Metabolit imunomodilatè yo se yon karakteristik kle nan mikwoanviwònman timè a (TME), men ak kèk eksepsyon, idantite yo rete lajman enkoni. La a, nou te analize timè ak selil T ki soti nan timè ak asit pasyan ki gen karsinom sereu wo degre (HGSC) pou revele metabolòm diferan konpatiman TME sa yo. Asit ak selil timè yo gen diferans metabolit anpil. Konpare ak asit, selil T ki enfiltre timè yo rich anpil nan 1-metilnikotinamid (MNA). Malgre ke nivo MNA nan selil T yo wo, ekspresyon nikotinamid N-metiltransferaz (yon anzim ki katalize transfè gwoup metil soti nan S-adenosilmetionin rive nan nikotinamid) limite a fibroblas ak selil timè. Fonksyonèlman, MNA pwovoke selil T yo sekrete sitokin ki ankouraje timè faktè nekwoz timè alfa. Se poutèt sa, MNA ki sòti nan TME kontribye nan règleman iminitè selil T yo epi li reprezante yon sib potansyèl pou iminoterapi pou tretman kansè imen.
Metabolit ki sòti nan timè yo ka gen yon gwo efè inibitwa sou iminite anti-timoral, epi de pli zan pli prèv montre ke yo kapab sèvi tou kòm yon fòs motè kle pou pwogresyon maladi a (1). Anplis efè Warburg la, travay resan yo te kòmanse karakterize eta metabolik selil timè yo ak relasyon li ak eta iminitè mikwoanviwònman timè a (TME). Etid sou modèl sourit ak selil T imen yo te montre ke metabolis glutamin (2), metabolis oksidatif (3) ak metabolis glikoz (4) ka aji endepandamman sou divès sougwoup selil iminitè yo. Plizyè metabolit nan chemen sa yo inibi fonksyon anti-timoral selil T yo. Li te pwouve ke blokaj koanzim tetraidrobiopterin (BH4) ka domaje pwoliferasyon selil T yo, epi ogmantasyon BH4 nan kò a ka amelyore repons iminitè anti-timoral ki medyatè pa CD4 ak CD8. Anplis de sa, efè imunosupresè kynurenine a ka sove pa administrasyon BH4 (5). Nan glioblastom mutant izositrat deidrojenaz (IDH), sekresyon enantiometabolik (R)-2-idroksiglutarat (R-2-HG) anpeche aktivasyon, pwoliferasyon ak aktivite sitoliz selil T yo (6). Dènyèman, yo te montre ke metilglioksal, yon sou-pwodui glikoliz, pwodui pa selil sipresè ki gen orijin myeloid, epi transfè metilglioksal pa selil T ka anpeche fonksyon selil efektè T yo. Nan tretman, netralizasyon metilglioksal la ka simonte aktivite selil sipresè ki sòti nan myeloid (MDSC) yo epi amelyore terapi blokaj pwen kontwòl yo yon fason sinèjik nan modèl sourit (7). Etid sa yo ansanm mete aksan sou wòl kle metabolit ki sòti nan TME yo nan reglemante fonksyon ak aktivite selil T yo.
Yo rapòte anpil pwoblèm disfonksyon selil T nan kansè nan ovè (8). Sa a se an pati akòz karakteristik metabolik ki genyen nan ipoksi ak vaskilati timè anòmal (9), ki lakòz konvèsyon glikoz ak triptofan an sou-pwodwi tankou asid laktik ak kynurenine. Twòp laktat ekstraselilè diminye pwodiksyon entèferon-γ (IFN-γ) epi li kondwi diferansyasyon sougwoup myelosupresif yo (10, 11). Konsomasyon triptofan anpeche dirèkteman pwopagasyon selil T epi anpeche siyalizasyon reseptè selil T (12-14). Malgre obsèvasyon sa yo, yo te fè anpil travay sou metabolis iminitè nan kilti selil T in vitro lè l sèvi avèk medya optimize, oswa limite a modèl sourit omolog in vivo, ni youn ni lòt pa reflete nèt eterogeneite kansè imen yo ak anviwònman makro ak mikwo fizyolojik la.
Yon karakteristik komen nan kansè nan ovè se pwopagasyon peritoneal ak aparans asit. Akimilasyon likid selilè nan asit asosye avèk maladi avanse ak move pronostik (15). Dapre rapò yo, konpatiman inik sa a ipoksik, li gen nivo segondè nan faktè kwasans andotelyal vaskilè (VEGF) ak indoleamin 2,3-dioksijenaz (IDO), epi li enfiltre pa selil regilatè T ak selil inibitè myeloid (15-18). Anviwònman metabolik asit la ka diferan de sa ki nan timè a li menm, kidonk repwogramasyon selil T yo nan espas peritoneal la pa klè. Anplis de sa, diferans kle yo ak eterogeneite ant asit ak metabolit ki prezan nan anviwònman timè a ka anpeche enfiltrasyon selil iminitè yo ak fonksyon yo sou timè yo, epi plis rechèch nesesè.
Pou nou te ka rezoud pwoblèm sa yo, nou te konsevwa yon metòd separasyon selil sansib ak kromatografi likid, yon metòd tandem mas spectrometri (LC-MS/MS) pou etidye diferan kalite selil (tankou selil T CD4+ ak CD8+) ansanm ak andedan ak ant timè yo. Metabolit li yo gaye sou selil ki nan menm anviwònman asit ak timè pasyan an. Nou itilize metòd sa a ansanm ak sitometri koule wo dimansyon ak sekans ARN yon sèl selil (scRNA-seq) pou bay yon pòtrè trè rezolisyon sou sitiyasyon metabolik popilasyon kle sa yo. Metòd sa a te revele yon ogmantasyon siyifikatif nan nivo 1-metilnikotinamid (MNA) nan selil T timè yo, epi eksperyans in vitro yo te montre ke efè imunomodilatè MNA sou fonksyon selil T yo te enkoni anvan. An jeneral, metòd sa a revele entèraksyon metabolik mityèl ant timè yo ak selil iminitè yo, epi li bay enfòmasyon inik sou metabolit regilasyon iminitè yo, ki ka itil pou tretman iminoterapi kansè nan ovè ki baze sou selil T. Opòtinite tretman.
Nou te itilize sitometri koule gwo dimansyon pou mezire an menm tan absòpsyon glikoz [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglikoz (2-NBDG) ak aktivite mitokondriyal [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) se makè tipik kòt a kòt ki distenge selil iminitè yo ak popilasyon selil timè yo (Tablo S2 ak Figi S1A). Analiz sa a te montre ke konpare ak selil T yo, asit ak selil timè yo gen pi gwo nivo absòpsyon glikoz, men yo gen pi piti diferans nan aktivite mitokondriyal. Absòpsyon glikoz mwayèn nan selil timè [CD45-EpCAM (EpCAM)+] se twa a kat fwa plis pase selil T yo, epi absòpsyon glikoz mwayèn nan selil CD4 + T yo se 1.2 fwa plis pase selil CD8 + T yo, ki endike lenfosit enfiltrasyon timè (TIL) yo gen diferan bezwen metabolik menm nan menm TME a (Figi 1A). Okontrè, aktivite mitokondriyal nan selil timè yo sanble ak sa ki nan selil CD4 + T yo, epi aktivite mitokondriyal tou de kalite selil yo pi wo pase sa ki nan selil CD8 + T yo (Figi 1B). An jeneral, rezilta sa yo revele nivo metabolik la. Aktivite metabolik selil timè yo pi wo pase sa ki nan selil CD4 + T yo, epi aktivite metabolik selil CD4 + T yo pi wo pase sa ki nan selil CD8 + T yo. Malgre efè sa yo atravè kalite selil yo, pa gen okenn diferans konsistan nan estati metabolik selil CD4 + ak CD8 + T yo oswa pwopòsyon relatif yo nan asit konpare ak timè yo (Figi 1C). Okontrè, nan fraksyon selil CD45 yo, pwopòsyon selil EpCAM+ nan timè a ogmante konpare ak asit (Figi 1D). Nou te obsève tou yon diferans metabolik klè ant konpozan selil EpCAM+ ak EpCAM- yo. Selil EpCAM+ (timè) yo gen yon absòpsyon glikoz ak yon aktivite mitokondriyal ki pi wo pase selil EpCAM- yo, ki pi wo pase aktivite metabolik fibroblas nan selil timè nan TME (Figi 1, E ak F).
(A ak B) Entansite fliyoresans medyàn (MFI) absòpsyon glikoz (2-NBDG) (A) ak aktivite mitokondriyal selil CD4 + T yo (MitoTracker wouj fonse) (B) Grafik reprezantatif (agoch) ak done tabile (Adwat), selil CD8 + T ak EpCAM + selil CD45-timè ki soti nan asit ak timè. (C) Rapò selil CD4 + ak CD8 + (nan selil CD3 + T) nan asit ak timè. (D) Pwopòsyon selil timè EpCAM + nan asit ak timè (CD45−). (E ak F) Absòpsyon glikoz EpCAM + CD45-timè ak EpCAM-CD45-matris (2-NBDG) (E) ak aktivite mitokondriyal (MitoTracker wouj fonse) (F) Grafik reprezantatif (agoch) ak done tabile (Adwat) Asit ak selil timè. (G) Grafik reprezantatif ekspresyon CD25, CD137 ak PD1 pa sitometri koule. (H ak I) Ekspresyon CD25, CD137 ak PD1 sou selil T CD4 + (H) ak selil T CD8 + (I). (J ak K) Fenotip nayif, memwa santral (Tcm), efèktè (Teff) ak memwa efèktè (Tem) ki baze sou ekspresyon CCR7 ak CD45RO. Imaj reprezantatif (agoch) ak done tabulaire (adwat) selil T CD4 + (J) ak selil T CD8 + (K) nan asit ak timè. Valè P detèmine pa tès t pè (*P<0.05, **P<0.01 ak ***P<0.001). Liy lan reprezante pasyan ki matche (n = 6). FMO, fluoresans mwens youn; MFI, entansite fluoresans medyàn.
Plis analiz te revele lòt diferans enpòtan ant estati fenotipik selil T ki byen rezoud yo. Memwa aktif (Figi 1, G rive I) ak memwa efèktè (Figi 1, J ak K) nan timè yo pi souvan pase asit (pwopòsyon selil CD3+ T). Menm jan an tou, analize fenotip la pa ekspresyon makè aktivasyon (CD25 ak CD137) ak makè rediksyon [pwoteyin lanmò selil pwograme 1 (PD1)] te montre ke byenke karakteristik metabolik popilasyon sa yo diferan (Figi S1, B rive E), pa gen okenn diferans metabolik enpòtan ki te obsève regilyèman ant sou-gwoup nayif, efèktè oswa memwa (Figi S1, F rive I). Rezilta sa yo te konfime lè l sèvi avèk metòd aprantisaj otomatik pou otomatikman asiyen fenotip selilè (21), ki te plis revele prezans yon gwo kantite selil mwèl zo (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) nan asit pasyan an (Figi S2A). Pami tout kalite selil idantifye yo, popilasyon selil myeloid sa a te montre pi gwo absòpsyon glikoz ak aktivite mitokondriyal (Figi S2, B rive G). Rezilta sa yo mete aksan sou gwo diferans metabolik ki genyen ant plizyè kalite selil yo jwenn nan asit ak timè nan pasyan ki gen HGSC.
Pi gwo defi pou konprann karakteristik metabonomik TIL yo se nesesite pou izole echantiyon selil T ki gen ase pite, kalite ak kantite nan timè yo. Etid resan yo montre ke metòd klasman ak anrichisman pèl ki baze sou sitometri koule ka mennen nan chanjman nan pwofil metabolit selilè yo (22-24). Pou simonte pwoblèm sa a, nou te optimize metòd anrichisman pèl la pou izole ak izole TIL nan kansè ovè imen ki te retire chirijikalman anvan analiz pa LC-MS/MS (gade Materyèl ak Metòd; Figi 2A). Pou evalye enpak jeneral pwotokòl sa a sou chanjman metabolit yo, nou te konpare pwofil metabolit selil T yo ki aktive pa donatè ki an sante apre etap separasyon pèl ki anwo a ak selil ki pa te separe ak pèl men ki te rete sou glas. Analiz kontwòl kalite sa a te jwenn ke gen yon gwo korelasyon ant de kondisyon sa yo (r = 0.77), epi repetabilite teknik gwoup 86 metabolit yo gen yon gwo repetabilite (Figi 2B). Se poutèt sa, metòd sa yo ka fè analiz metabolit egzat nan selil ki sibi anrichisman kalite selilè, kidonk bay premye platfòm wo rezolisyon pou idantifye metabolit espesifik nan HGSC, kidonk pèmèt moun yo gen yon konpreyansyon pi pwofon sou espesifikite selilè pwogram metabolis seksyèl la.
(A) Dyagram eskematik anrichisman pèl mayetik. Anvan analiz pa LC-MS/MS, selil yo pral sibi twa seri anrichisman pèl mayetik youn apre lòt oswa rete sou glas. (B) Efè kalite anrichisman sou abondans metabolit yo. Mwayèn twa mezi pou chak kalite anrichisman ± SE. Liy gri a reprezante yon relasyon 1:1. Korelasyon intra-klas (ICC) mezi repete yo montre nan etikèt aks la. NAD, nikotinamid adenin dinikleotid. (C) Dyagram eskematik workflow analiz metabolit pasyan an. Asit oswa timè yo kolekte nan men pasyan yo epi yo kriyoprezève. Yon ti pòsyon nan chak echantiyon te analize pa sitometri koule, pandan ke echantiyon ki rete yo te sibi twa seri anrichisman pou selil CD4+, CD8+ ak CD45-. Fraksyon selil sa yo te analize lè l sèvi avèk LC-MS/MS. (D) Kat chalè abondans metabolit estanda. Dendrogram nan reprezante gwoupman Ward nan distans euklidyen ant echantiyon yo. (E) Analiz konpozan prensipal (PCA) nan kat metabolit echantiyon an, ki montre twa replik chak echantiyon, echantiyon ki soti nan menm pasyan an konekte pa yon liy. (F) PCA pwofil metabolit echantiyon an kondisyone sou pasyan an (sa vle di, lè l sèvi avèk redondans pasyèl); kalite echantiyon an limite pa koki konvèks la. PC1, konpozan prensipal 1; PC2, konpozan prensipal 2.
Apre sa, nou te aplike metòd anrichisman sa a pou analize 99 metabolit nan fraksyon selil CD4 +, CD8 + ak CD45- yo nan asit prensipal ak timè sis pasyan HGSC (Figi 2C, Figi S3A ak Tablo S3 ak S4). Popilasyon enterès la reprezante 2% a 70% nan gwo echantiyon orijinal selil vivan yo, epi pwopòsyon selil yo varye anpil ant pasyan yo. Apre separasyon pèl yo, fraksyon enterès anrichi a (CD4+, CD8+ oswa CD45-) reprezante an mwayèn plis pase 85% nan tout selil vivan nan echantiyon an. Metòd anrichisman sa a pèmèt nou analize popilasyon selil ki soti nan metabolis tisi timè imen, ki enposib pou fè nan gwo echantiyon. Lè nou itilize pwotokòl sa a, nou te detèmine ke l-kynurenine ak adenozin, de metabolit imunosupresè byen karakterize sa yo, te ogmante nan selil T timè oswa selil timè (Figi S3, B ak C). Se poutèt sa, rezilta sa yo demontre fidelite ak kapasite teknoloji separasyon selilè ak espektwometri mas nou an pou jwenn metabolit byolojikman enpòtan nan tisi pasyan yo.
Analiz nou an te revele tou yon gwo separasyon metabolik nan kalite selil yo nan pasyan yo ak ant pasyan yo (Figi 2D ak Figi S4A). An patikilye, konpare ak lòt pasyan yo, pasyan 70 te montre diferan karakteristik metabolik (Figi 2E ak Figi S4B), sa ki endike ke ka gen yon eterogeneite metabolik sibstansyèl ant pasyan yo. Li enpòtan pou note ke konpare ak lòt pasyan yo (1.2 a 2 lit; Tablo S1), kantite total asit ki te kolekte nan pasyan 70 (80 ml) te pi piti. Kontwòl eterogeneite ant pasyan yo pandan analiz eleman prensipal yo (pa egzanp, lè l sèvi avèk analiz redondans pasyèl) montre chanjman konsistan ant kalite selil yo, epi kalite selil yo ak/oswa mikwoanviwònman yo byen agreje dapre pwofil metabolit la (Figi 2F). Analiz metabolit endividyèl yo te mete aksan sou efè sa yo epi li te revele diferans enpòtan ant kalite selil yo ak mikwoanviwònman an. Li enpòtan pou note ke diferans ki pi ekstrèm ki obsève a se MNA, ki anjeneral rich nan selil CD45- ak nan selil CD4+ ak CD8+ ki enfiltre timè a (Figi 3A). Pou selil CD4 + yo, efè sa a pi evidan, epi MNA ki nan selil CD8 + yo sanble afekte anpil pa anviwònman an tou. Sepandan, sa pa enpòtan, paske se sèlman twa nan sis pasyan yo ki ka evalye pou nòt CD8+ timè yo. Anplis MNA, nan diferan kalite selil nan asit ak timè, lòt metabolit ki mal karakterize nan TIL yo rich tou yon fason diferan (Figi S3 ak S4). Se poutèt sa, done sa yo revele yon seri metabolit imunomodilatè pwomètè pou plis rechèch.
(A) Kontni MNA nòmalize nan selil CD4+, CD8+ ak CD45- ki soti nan asit ak timè. Dyagram bwat la montre medyàn lan (liy lan), ranje entèkatil la (frame charn) ak ranje done yo, jiska 1.5 fwa ranje entèkatil la (frame whisker). Jan sa dekri nan Materyèl ak Metòd Pasyan yo, sèvi ak valè limma pasyan an pou detèmine valè P a (*P<0.05 ak **P<0.01). (B) Dyagram eskematik metabolis MNA (60). Metabolit: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-omosisteyin; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridòn-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridòn-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboz; NMN, nikotinamid mononikleotid. Anzim (vèt): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaz; SIRT, sirtuin; NAMPT, nikotinamid fosforibosil transferaz; AOX1, aldeid oksidaz 1; NRK, nikotinamid ribozid kinaz; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenilat transferaz; Pnp1, purin nukleozid fosforilaz. (C) t-SNE nan scRNA-seq asit (gri) ak timè (wouj; n = 3 pasyan). (D) Ekspresyon NNMT nan diferan popilasyon selil idantifye lè l sèvi avèk scRNA-seq. (E) Ekspresyon NNMT ak AOX1 nan SK-OV-3, ren anbriyonik imen (HEK) 293T, selil T ak selil T trete ak MNA. Ekspresyon ki pliye a montre an relasyon ak SK-OV-3. Modèl ekspresyon ak SEM montre (n = 6 donatè ki an sante). Valè Ct ki pi gran pase 35 yo konsidere kòm endetektab (UD). (F) Ekspresyon SLC22A1 ak SLC22A2 nan SK-OV-3, HEK293T, selil T ak selil T trete ak 8mM MNA. Ekspresyon ki pliye a montre anrapò ak SK-OV-3. Modèl ekspresyon ak SEM lan montre (n = 6 donatè ki an sante). Valè Ct ki pi gran pase 35 yo konsidere kòm endetektab (UD). (G) Kontni MNA selilè nan selil donatè T ki an sante aktive apre 72 èdtan enkubasyon ak MNA. Modèl ekspresyon ak SEM lan montre (n = 4 donatè ki an sante).
Yo pwodui MNA lè yo transfere gwoup metil la soti nan S-adenosil-1-metionin (SAM) pou ale nan nikotinamid (NA) pa nikotinamid N-metiltransferaz (NNMT; Figi 3B). NNMT twò eksprime nan yon varyete kansè imen epi li asosye avèk pwoliferasyon, envazyon ak metastaz (25-27). Pou pi byen konprann sous MNA nan selil T nan TME, nou te itilize scRNA-seq pou karakterize ekspresyon NNMT atravè kalite selil nan asit ak timè twa pasyan HGSC (Tablo S5). Analiz apeprè 6,500 selil te montre ke nan anviwònman asit ak timè, ekspresyon NNMT te limite a popilasyon prezime fibroblast ak selil timè yo (Figi 3, C ak D). Li enpòtan pou note ke pa gen okenn ekspresyon NNMT evidan nan okenn popilasyon ki eksprime PTPRC (CD45 +) (Figi 3D ak Figi S5A), ki endike ke MNA detekte nan spectre metabolit la te entwodui nan selil T yo. Ekspresyon aldeid oksidaz 1 (AOX1) konvèti MNA an 1-metil-2-piridòn-5-karboksamid (2-PYR) oswa 1-metil-4-piridòn-5-karboksamid (4-PYR); Figi 3B) limite tou a popilasyon fibroblas ki eksprime COL1A1 (Figi S5A), ki ansanm endike ke selil T yo pa gen kapasite metabolis MNA konvansyonèl la. Modèl ekspresyon jèn ki gen rapò ak MNA sa yo te verifye lè l sèvi avèk yon dezyèm seri done selil endepandan ki soti nan asit pasyan HGSC yo (Figi S5B; n = 6) (16). Anplis de sa, analiz reyaksyon chèn polimeraz kantitatif (qPCR) nan selil T donatè ki an sante trete ak MNA te montre ke konpare ak selil timè ovè SK-OV-3 kontwòl yo, NNMT oswa AOX1 prèske pa t eksprime (Figi 3E). Rezilta inatandi sa yo endike ke MNA ka sekrete nan fibroblas oswa timè nan selil T adjasan nan TME.
Malgre ke kandida yo enkli fanmi transpòtè kasyon òganik 1 a 3 (OCT1, OCT2 ak OCT3) kode pa fanmi transpòtè soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ak SLC22A3), transpòtè potansyèl MNA yo toujou pa defini (28). QPCR ARNm ki soti nan selil T donatè ki an sante te montre nivo ekspresyon SLC22A1 ki ba men nivo SLC22A2 ki pa detektab, sa ki konfime ke li te deja rapòte nan literati a (Figi 3F) (29). Okontrè, liy selil timè ovè SK-OV-3 la te eksprime nivo segondè nan tou de transpòtè yo (Figi 3F).
Pou teste posiblite pou selil T yo gen kapasite pou absòbe MNA etranje, yo te kiltive selil T donatè ki an sante pandan 72 èdtan an prezans diferan konsantrasyon MNA. Nan absans MNA ekzojèn, yo pa ka detekte kontni selilè MNA a (Figi 3G). Sepandan, selil T aktive trete ak MNA ekzojèn te montre yon ogmantasyon nan kontni MNA nan selil yo ki depann de dòz la, jiska 6 mM MNA (Figi 3G). Rezilta sa a endike ke malgre nivo ekspresyon transpòtè ki ba a ak mank anzim prensipal ki responsab pou metabolis MNA entraselulè a, TIL ka toujou absòbe MNA.
Espèk metabolit ki nan selil T pasyan yo ak eksperyans absòpsyon MNA in vitro yo ogmante posiblite pou fibroblas ki asosye ak kansè (CAF) sekrete MNA epi selil timè yo ka kontwole fenotip ak fonksyon TIL. Pou detèmine efè MNA sou selil T yo, selil T donatè ki an sante yo te aktive in vitro an prezans oswa absans MNA, epi yo te evalye pwoliferasyon ak pwodiksyon sitokin yo. Apre 7 jou yo te ajoute MNA nan dòz ki pi wo a, kantite double popilasyon an te redwi yon fason modere, pandan y ap vigè te kenbe nan tout dòz yo (Figi 4A). Anplis de sa, tretman MNA ekzojèn te lakòz yon ogmantasyon nan pwopòsyon selil T CD4 + ak CD8 + ki eksprime faktè nekwoz timè-α (TNFα; Figi 4B). Okontrè, pwodiksyon entraselulè IFN-γ te redwi anpil nan selil T CD4 + yo, men pa nan selil T CD8 + yo, epi pa te gen okenn chanjman siyifikatif nan interleukin 2 (IL-2; Figi 4, C ak D). Se poutèt sa, tès imunosorban lye ak anzim (ELISA) sou sipernatan ki soti nan kilti selil T trete ak MNA sa yo te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan TNFα, yon diminisyon nan IFN-γ, epi pa gen okenn chanjman nan IL-2 (Figi 4, E rive G). Diminisyon IFN-γ a endike ke MNA ka jwe yon wòl nan inibisyon aktivite anti-timoral selil T yo. Pou simile efè MNA sou sitotoksisite ki medyatè pa selil T, selil reseptè antijèn chimerik T (FRα-CAR-T) ki vize reseptè folat α ak CAR-T (GFP) ki reglemante pa selil pwoteyin fliyoresan vèt (GFP) -CAR-T) yo pwodui pa selil mononikleyè san periferik (PBMC) donatè ki an sante. Selil CAR-T yo te kiltive pandan 24 èdtan an prezans MNA, epi answit yo te ko-kiltive ak selil timè ovè SK-OV-3 imen ki eksprime reseptè folat α nan yon rapò efèktè-sib 10:1. Tretman MNA a te lakòz yon diminisyon siyifikatif nan aktivite touye selil FRα-CAR-T yo, ki te sanble ak selil FRα-CAR-T trete yo ak adenozin (Figi 4H).
(A) Kantite total selil ki ka viv ak double popilasyon an (PD) dirèkteman nan kilti a nan jou 7. Grafik ba a reprezante mwayèn + SEM sis donatè ki an sante. Reprezante done ki soti nan omwen n = 3 eksperyans endepandan. (B rive D) CD3/CD28 ak IL-2 yo te itilize pou aktive selil T yo nan konsantrasyon MNA respektif yo pandan 7 jou. Anvan analiz la, selil yo te estimile ak PMA/yonomisin ak GolgiStop pandan 4 èdtan. Ekspresyon TNFα (B) nan selil T yo. Imaj egzanp (agoch) ak done tablè (adwat) nan ekspresyon TNFα nan selil vivan. Ekspresyon IFN-γ (C) ak IL-2 (D) nan selil T yo. Ekspresyon sitokin yo te mezire pa sitometri koule. Grafik ba a reprezante mwayèn (n = 6 donatè ki an sante) + SEM. Sèvi ak analiz varyans yon sèl chemen ak mezi repete (*P<0.05 ak **P<0.01) pou detèmine valè P a. Reprezante done ki soti nan omwen n = 3 eksperyans endepandan. (E rive G) Yo te itilize CD3/CD28 ak IL-2 pou aktive selil T yo nan konsantrasyon MNA respektif yo pandan 7 jou. Yo te kolekte medyòm nan anvan ak apre 4 èdtan estimilasyon PMA/yonomisin. Yo te mezire konsantrasyon TNFα (E), IFN-γ (F) ak IL-2 (G) yo pa ELISA. Grafik ba a reprezante mwayèn nan (n = 5 donatè ki an sante) + SEM. Valè P detèmine lè l sèvi avèk analiz varyans yon sèl chemen ak mezi repete (*P<0.05). Liy pwentiye a endike limit deteksyon deteksyon an. (H) Tès liz selilè. Selil FRα-CAR-T oswa GFP-CAR-T yo te ajiste ak adenozin (250μM) oswa MNA (10 mM) pandan 24 èdtan, oswa yo te kite yo san tretman (Ctrl). Yo te mezire pousantaj touye selil SK-OV-3 yo. Valè P detèmine pa tès Welch t (*P<0.5 ak **P<0.01).
Pou nou te ka konprann mekanis regilasyon ekspresyon TNFα ki depann de MNA a, nou te evalye chanjman ki fèt nan ARNm TNFα selil T trete ak MNA yo (Figi 5A). Selil T donatè ki an sante trete ak MNA te montre yon ogmantasyon de fwa plis nan nivo transkripsyon TNFα yo, sa ki endike ke MNA depann de regilasyon transkripsyon TNFα. Pou envestige posib mekanis regilasyon sa a, nou te evalye de faktè transkripsyon li te ye ki reglemante TNFα, sètadi faktè nikleyè selil T aktive (NFAT) ak pwoteyin espesifik 1 (Sp1), an repons a lyezon MNA ak pwomotè TNFα proksimal la (30). Pwomotè TNFα a gen 6 sit lyezon NFAT idantifye ak 2 sit lyezon Sp1, ki sipèpoze nan yon sèl sit [-55 pè baz (bp) soti nan bouchon 5' la] (30). Iminopresipitasyon kromatin (ChIP) te montre ke lè yo trete ak MNA, lyezon Sp1 ak pwomotè TNFα a ogmante twa fwa plis. Enkòporasyon NFAT la te ogmante tou epi li te apwoche enpòtans li (Figi 5B). Done sa yo endike ke MNA kontwole ekspresyon TNFα atravè transkripsyon Sp1, epi nan yon pi piti mezi ekspresyon NFAT.
(A) Konpare ak selil T ki kiltive san MNA, chanjman nan ekspresyon TNFα nan selil T trete ak MNA. Modèl ekspresyon an ak SEM montre (n = 5 donatè ki an sante). Reprezante done ki soti nan omwen n = 3 eksperyans endepandan. (B) Pwomotè TNFα nan selil T trete avèk oswa san 8 mM MNA apre NFAT ak Sp1 te konbine avèk (Ctrl) ak estimilasyon PMA/yonomisin pandan 4 èdtan. Iminoglobulin G (IgG) ak H3 te itilize kòm kontwòl negatif ak pozitif pou imunoprecipitasyon, respektivman. Kantifikasyon ChIP la te montre ke lyezon Sp1 ak NFAT ak pwomotè TNFα nan selil trete ak MNA ogmante plizyè fwa konpare ak kontwòl la. Reprezante done ki soti nan omwen n = 3 eksperyans endepandan. Valè P detèmine pa plizyè tès t (*** P <0.01). (C) Konpare ak asit HGSC yo, selil T (ki pa sitotoksik) te montre yon ekspresyon TNF ogmante nan timè a. Koulè yo reprezante diferan pasyan. Selil yo montre yo te echantiyone owaza jiska 300 epi yo te chanje pou limite twòp itilizasyon (** Padj = 0.0076). (D) Modèl MNA pwopoze pou kansè nan ovè. MNA pwodui nan selil timè ak fibroblas nan TME epi selil T yo absòbe li. MNA ogmante lyezon Sp1 ak pwomotè TNFα a, sa ki mennen nan yon ogmantasyon transkripsyon TNFα ak pwodiksyon sitokin TNFα. MNA lakòz tou yon diminisyon nan IFN-γ. Inibisyon fonksyon selil T mennen nan yon rediksyon nan kapasite pou touye epi akselere kwasans timè a.
Selon rapò yo, TNFα gen efè anti-timè ak anti-timè ki depann sou devan ak dèyè, men li gen yon wòl byen koni nan pwomosyon kwasans ak metastaz kansè nan ovè (31-33). Selon rapò yo, konsantrasyon TNFα nan asit ak tisi timè nan pasyan ki gen kansè nan ovè pi wo pase sa ki nan tisi benin (34-36). An tèm de mekanis, TNFα ka kontwole aktivasyon, fonksyon ak pwopagasyon globil blan yo, epi chanje fenotip selil kansè yo (37, 38). An akò avèk rezilta sa yo, analiz ekspresyon jèn diferansyèl te montre ke TNF te siyifikativman ogmante nan selil T nan tisi timè konpare ak asit (Figi 5C). Ogmantasyon nan ekspresyon TNF te sèlman evidan nan popilasyon selil T ki gen yon fenotip ki pa sitotoksik (Figi S5A). An rezime, done sa yo sipòte opinyon ke MNA gen doub efè imunosupresè ak pwomosyon timè nan HGSC.
Maketaj fliyorèsan ki baze sou sitometri koule vin tounen metòd prensipal pou etidye metabolis TIL. Etid sa yo montre ke konpare ak lenfosit san periferik oswa selil T ki soti nan ògàn lenfoid segondè yo, TIL murin ak imen yo gen yon tandans ki pi wo pou absòbe glikoz (4, 39) ak pèt gradyèl fonksyon mitokondriyal (19, 40). Malgre ke nou te obsève rezilta menm jan an nan etid sa a, devlopman kle a se konpare metabolis selil timè yo ak TIL ki soti nan menm tisi timè ki te rezeke a. An akò ak kèk nan rapò anvan sa yo, selil timè (CD45-EpCAM +) ki soti nan asit ak timè yo gen yon absòpsyon glikoz ki pi wo pase selil CD8 + ak CD4 + T yo, sa ki sipòte ke absòpsyon glikoz ki wo nan selil timè yo ka konpare ak selil T yo. Konsèp konpetisyon selil T yo. TME. Sepandan, aktivite mitokondriyal selil timè yo pi wo pase sa selil CD8 + T yo, men aktivite mitokondriyal la sanble ak sa selil CD4 + T yo. Rezilta sa yo ranfòse tèm émergentes ke metabolis oksidatif enpòtan pou selil timè yo (41, 42). Yo sijere tou ke selil CD8 + T yo ka pi sansib a disfonksyon oksidatif pase selil CD4 + T yo, oubyen ke selil CD4 + T yo ka itilize lòt sous kabòn apa glikoz pou kenbe aktivite mitokondriyal (43, 44). Li enpòtan pou note ke nou pa obsève okenn diferans nan absòpsyon glikoz oswa aktivite mitokondriyal ant efektè CD4 + T yo, memwa efektè T yo ak selil memwa santral T yo nan asit. Menm jan an tou, eta diferansyasyon selil CD8 + T yo nan timè yo pa gen anyen pou wè ak chanjman nan absòpsyon glikoz, sa ki mete aksan sou diferans enpòtan ki genyen ant selil T yo kiltive in vitro ak TIL imen in vivo (22). Obsèvasyon sa yo te konfime tou pa itilizasyon alokasyon popilasyon selil otomatik san patipri, ki te revele plis ke selil CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ki gen pi gwo absòpsyon glikoz ak aktivite mitokondriyal pase selil timè yo répandu men yo gen yon popilasyon selil metabolik aktif. Popilasyon sa a ka reprezante swadizan soupopilasyon selil siprimeur myeloid oswa selil dendritik plasmasitoid yo idantifye nan analiz scRNA-seq la. Malgre ke yo te rapòte tou de nan timè ovè imen [45], yo toujou bezwen plis travay pou dekri soupopilasyon myeloid sa a.
Malgre ke metòd ki baze sou sitometri koule ka klarifye diferans jeneral ki genyen nan metabolis glikoz ak oksidatif ant kalite selil yo, metabolit presi ki pwodui pa glikoz oswa lòt sous kabòn pou metabolis mitokondriyal nan TME poko detèmine. Pou asiyen prezans oswa absans metabolit yo a yon sou-gwoup TIL bay, sa mande pou pirifye popilasyon selilè a nan tisi ki te retire a. Se poutèt sa, metòd anrichisman selilè nou an konbine avèk espektwometri mas ka bay enfòmasyon sou metabolit ki anrichi yon fason diferan nan selil T ak popilasyon selil timè nan echantiyon pasyan ki koresponn yo. Malgre ke metòd sa a gen avantaj sou klasman selil aktive pa fluoresans, sèten bibliyotèk metabolit yo ka afekte akòz estabilite natirèl ak/oswa vitès woulman rapid (22). Malgre sa, metòd nou an te kapab idantifye de metabolit imunosupresè rekonèt, adenosin ak kinurenin, paske yo varye anpil ant kalite echantiyon yo.
Analiz metabonomik nou an sou timè yo ak soutip TIL yo bay plis enfòmasyon sou wòl metabolit yo nan TME ovè a. Premyèman, lè l sèvi avèk sitometri koule, nou te detèmine ke pa te gen okenn diferans nan aktivite mitokondriyal ant timè yo ak selil T CD4 + yo. Sepandan, analiz LC-MS/MS te revele chanjman siyifikatif nan abondans metabolit yo nan mitan popilasyon sa yo, sa ki endike ke konklizyon sou metabolis TIL ak aktivite metabolik jeneral li mande pou yon entèpretasyon atansyon. Dezyèmman, MNA se metabolit ki gen pi gwo diferans ant selil CD45 yo ak selil T yo nan asit, pa nan timè yo. Se poutèt sa, konpatimantalizasyon ak lokalizasyon timè a ka gen efè diferan sou metabolis TIL, ki mete aksan sou posiblite eterogeneite nan yon mikwoanviwònman bay. Twazyèmman, ekspresyon anzim NNMT ki pwodui MNA a limite sitou a CAF, ki se selil timè nan yon pi piti limit, men yo obsève nivo MNA detektab nan selil T ki sòti nan timè yo. Twòp ekspresyon NNMT nan CAF ovè a gen yon efè pwomosyon kansè li te ye, an pati akòz pwomosyon metabolis CAF, envazyon timè ak metastaz (27). Malgre nivo TIL an jeneral modere, ekspresyon NNMT nan CAF gen yon relasyon sere avèk soutip mezenkimal Cancer Genome Atlas (TCGA) la, ki asosye avèk yon move pronostik (27, 46, 47). Finalman, ekspresyon anzim AOX1 ki responsab degradasyon MNA a limite tou nan popilasyon CAF la, sa ki endike ke selil T yo pa gen kapasite pou metabolize MNA. Rezilta sa yo sipòte lide ke byenke plis travay nesesè pou verifye rezilta sa a, nivo MNA ki wo nan selil T yo ka endike prezans yon mikwoanviwònman CAF ki imunosupresè.
Etandone nivo ekspresyon transpòtè MNA yo ki ba ak nivo pwoteyin kle ki enplike nan metabolis MNA yo ki pa ka detekte, prezans MNA nan selil T yo se yon bagay ki pa t atann. Yo pa t ka detekte ni NNMT ni AOX1 pa analiz scRNA-seq ak qPCR siblé sou de gwoup endepandan. Rezilta sa yo endike ke selil T yo pa sentetize MNA, men li absòbe nan TME ki antoure a. Eksperyans in vitro yo montre ke selil T yo gen tandans akimile MNA ekzojèn.
Etid in vitro nou yo montre ke MNA ekzojèn pwovoke ekspresyon TNFα nan selil T yo epi li amelyore lyezon Sp1 ak pwomotè TNFα a. Malgre ke TNFα gen tou de fonksyon anti-timè ak anti-timè, nan kansè nan ovè, TNFα ka ankouraje kwasans kansè nan ovè (31-33). Netralizasyon TNFα nan kilti selil timè ovè oswa eliminasyon siyal TNFα nan modèl sourit ka amelyore pwodiksyon sitokin enflamatwa medyatè pa TNFα epi anpeche kwasans timè (32, 35). Se poutèt sa, nan ka sa a, MNA ki sòti nan TME ka aji kòm yon metabolit pro-enflamatwa atravè yon mekanis depandan de TNFα atravè bouk otokrin lan, kidonk ankouraje aparisyon ak pwopagasyon kansè nan ovè (31). Baze sou posibilite sa a, y ap etidye blokaj TNFα kòm yon ajan terapetik potansyèl pou kansè nan ovè (37, 48, 49). Anplis de sa, MNA afekte sitotoksisite selil CAR-T yo sou selil timè ovè yo, sa ki bay plis prèv pou sipresyon iminitè medyatè pa MNA. Ansanm, rezilta sa yo sijere yon modèl kote timè yo ak selil CAF yo sekrete MNA nan TME ekstraselilè. Atravè (i) estimilasyon kwasans kansè nan ovè pwovoke pa TNF ak (ii) inibisyon aktivite sitotoksik selil T pwovoke pa MNA, sa ka gen yon doub efè timè (Figi 5D).
An konklizyon, lè yo aplike yon konbinezon anrichisman selilè rapid, sekansaj yon sèl selil ak pwofilaj metabolik, etid sa a te revele gwo diferans imunometabolomik ant timè ak selil asit nan pasyan HGSC yo. Analiz konplè sa a te montre ke gen diferans nan absòpsyon glikoz ak aktivite mitokondriyal ant selil T yo, epi li idantifye MNA kòm yon metabolit regilatè iminitè otonòm ki pa selilè. Done sa yo gen yon enpak sou fason TME afekte metabolis selil T nan kansè imen yo. Malgre ke yo rapòte konpetisyon dirèk pou eleman nitritif ant selil T ak selil kansè yo, metabolit yo kapab tou aji kòm regilatè endirèk pou ankouraje pwogresyon timè a epi pètèt siprime repons iminitè andojèn yo. Deskripsyon plis sou wòl fonksyonèl metabolit regilatè sa yo ka louvri estrateji altènatif pou amelyore repons iminitè anti-timè a.
Yo te jwenn echantiyon pasyan yo ak done klinik yo atravè depo tisi timè kansè BC ki sètifye pa Rezo Depo Tisi Kanadyen an. Selon pwotokòl Komite Etik Rechèch Kansè BC ak Inivèsite British Columbia (H07-00463) apwouve a, tout echantiyon ak done klinik pasyan yo te jwenn konsantman enfòme alekri oswa yo te renonse fòmèlman bay konsantman yo. Echantiyon yo estoke nan BioBank sètifye a (BRC-00290). Karakteristik detaye pasyan yo montre nan Tablo S1 ak S5. Pou kriyoprezèvasyon, yo itilize yon bistouri pou dekonpoze mekanikman echantiyon timè pasyan an epi answit pouse li nan yon filt 100 mikron pou jwenn yon sispansyon selil endividyèl. Yo te santrifije asit pasyan an a 1500 rpm pandan 10 minit a 4°C pou fè grenn selil yo epi retire sipènatant la. Selil yo te jwenn nan timè ak asit yo te kriyoprezève nan 50% serom AB imen inaktif pa chalè (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ak 10% dimetil silfoksid. Sispansyon selil endividyèl sa yo te dekonjle epi yo te itilize pou metabolomik ak detèminasyon metabolit jan sa dekri anba a.
Mwayen konplè a konsiste de 0.22 μm filtre 50:50 siplemante RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) siplemante ak 10% seròm AB imen inaktif pa chalè (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x solisyon Penisilin Streptomisin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) ak 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) siplemante ak 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ak 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Tanpon koloran sitomèt koule a te konsiste de 0.22μm saline filtre tampon fosfat (PBS; Invitrogen) siplemante ak 3% seròm AB imen inaktif pa chalè (Sigma). Tanpon anrichisman selilè a konpoze de 0.22μm PBS filtre epi complété ak 0.5% serom AB imen inaktif pa chalè (Sigma-Aldrich).
Nan yon medyòm konplè a 37°C, selil yo te kolore ak 10 nM MT DR ak 100 μM 2-NBDG pandan 30 minit. Apre sa, selil yo te kolore ak lank viabilité eF506 a 4°C pandan 15 minit. Resispann selil yo nan FC Block (eBioscience) ak Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), delye nan tanpon koloran sitometri koule (dapre enstriksyon manifakti a), epi enkube pandan 10 minit nan tanperati chanm. Kolore selil yo ak yon seri antikò (Tablo S2) nan tanpon koloran sitometri koule a 4°C pandan 20 minit. Resispann selil yo nan tanpon koloran sitometri koule (Cytek Aurora; konfigirasyon 3L-16V-14B-8R) anvan analiz la. Sèvi ak SpectroFlo ak FlowJo V10 pou analize done kontaj selil yo, epi sèvi ak GraphPad Prism 8 pou kreye done yo. Yo te normalize logaritmikman entansite fliyoresans medyàn (MFI) 2-NBDG ak MT DR a, epi answit yo te itilize yon tès t pè pou analiz estatistik pou pran an kont pasyan ki matche yo. Retire tout popilasyon ki gen mwens pase 40 evènman nan analiz la; antre yon valè MFI 1 pou nenpòt valè negatif anvan ou fè analiz estatistik ak vizyalizasyon done yo.
Pou nou te ka konplete estrateji kontwòl manyèl panèl pwosesis ki anwo a, nou te itilize anotasyon konplè pa pyebwa restriksyon fòm (FAUST) (21) pou nou te otomatikman plase selil nan popilasyon an apre nou te fin elimine selil mouri yo nan FlowJo. Nou jere rezilta a manyèlman pou nou mete popilasyon ki sanble mal plase yo ansanm (konbine PD1+ ak selil timè PD1 yo) ak popilasyon ki rete yo. Chak echantiyon gen an mwayèn plis pase 2% selil, pou yon total 11 popilasyon.
Yo te itilize santrifijasyon dansite gradyan Ficoll pou separe PBMC yo ak pwodui separasyon lekosit yo (STEMCELL Technologies). Yo te izole selil T CD8 + yo nan PBMC lè l sèvi avèk CD8 MicroBeads (Miltenyi) epi yo te elaji yo nan yon medyòm konplè lè l sèvi avèk TransAct (Miltenyi) pandan 2 semèn dapre enstriksyon manifakti a. Yo te kite selil yo repoze pandan 5 jou nan yon medyòm konplè ki gen IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), epi answit yo te re-estimile yo ak TransAct. Nan 7yèm jou a, dapre enstriksyon manifakti a, yo te itilize CD45 MicroBeads imen (Miltenyi) pou anrichi selil yo nan twa seri youn apre lòt. Yo te divize selil yo an alikòt pou analiz sitometri koule (jan sa dekri pi wo a), epi yo te divize yon milyon selil an alikòt twa fwa pou analiz LC-MS/MS. Yo te trete echantiyon yo pa LC-MS/MS jan sa dekri anba a. Nou te estime valè metabolit ki manke a ak yon kantite iyon 1,000. Chak echantiyon nòmalize pa kantite total iyon an (TIC), konvèti logaritmikman epi nòmalize otomatikman nan MetaboAnalystR anvan analiz la.
Yo te dekonjle sispansyon selil endividyèl chak pasyan an epi yo te filtre l nan yon filt 40 μm pou l vin tounen yon mwayen konplè (jan sa dekri pi wo a). Selon pwotokòl manifakti a, yo te itilize twa seri seleksyon pozitif youn apre lòt pa separasyon mayetik ak MicroBeads (Miltenyi) pou anrichi echantiyon yo pou selil CD8+, CD4+ ak CD45- (sou glas). An brèf, yo te resispann selil yo nan yon tanpon anrichisman selilè (jan sa dekri pi wo a) epi yo te konte yo. Yo te enkube selil yo ak pèl CD8 imen, pèl CD4 imen oswa pèl CD45 imen (Miltenyi) a 4°C pandan 15 minit, epi answit yo te lave yo ak yon tanpon anrichisman selilè. Yo te pase echantiyon an nan kolòn LS la (Miltenyi), epi yo te kolekte fraksyon pozitif ak negatif yo. Pou diminye dire a epi maksimize etap rekiperasyon selilè a, yo itilize fraksyon CD8 la pou dezyèm seri anrichisman CD4+ la, epi yo itilize fraksyon CD4 la pou anrichisman CD45 ki vin apre a. Kenbe solisyon an sou glas pandan tout pwosesis separasyon an.
Pou prepare echantiyon yo pou analiz metabolit yo, yo te lave selil yo yon fwa avèk yon solisyon sèl glase, epi yo te ajoute 1 ml metanòl 80% nan chak echantiyon, answit yo te brase yo nan vortex epi yo te konjele yo rapidman nan nitwojèn likid. Echantiyon yo te sibi twa sik konjelasyon-dekonjlasyon epi yo te santrifije yo a 14,000 rpm pandan 15 minit a 4°C. Yo te evapore sipènatant ki gen metabolit yo jiskaske li sèk. Yo te fonn metabolit yo ankò nan 50 μl asid formik 0.03%, yo te brase yo nan vortex pou melanje yo, epi answit yo te santrifije yo pou retire debri yo.
Ekstrè metabolit yo jan sa dekri pi wo a. Transfere sipènatant la nan yon boutèy kromatografi likid pèfòmans segondè pou rechèch metabolomik. Sèvi ak yon pwotokòl tretman o aza pou trete chak echantiyon ak yon kantite selil menm jan an pou anpeche efè pakèt. Nou te fè yon evalyasyon kalitatif sou metabolit mondyal yo ki te pibliye deja sou AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Analiz kromatografik ak entegrasyon zòn pik yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl MultiQuant vèsyon 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Yo te itilize yon konte iyon 1000 pou estime valè metabolit ki manke a, epi yo te itilize TIC chak echantiyon pou kalkile zòn pik nòmalize chak metabolit detekte pou korije chanjman ki te entwodui pa analiz enstrimantal la nan pwosesis echantiyon an. Apre yo fin nòmalize TIC a, yo itilize MetaboAnalystR(51) (paramèt default) pou konvèsyon logaritmik ak eskalad liy nòm otomatik. Nou te itilize PCA ak pake vegan R pou fè analiz eksploratwa sou diferans metabolòm ant kalite echantiyon yo, epi nou te itilize analiz redondans pasyèl pou analize pasyan yo. Nou te itilize metòd Ward pou konstwi yon dendrogram kat chalè pou gwoupe distans euklidyen ant echantiyon yo. Nou te itilize limma (52) sou abondans metabolit estanda pou idantifye metabolit ki abondan diferan atravè tout kalite selil la ak mikwoanviwònman an. Pou senplifye eksplikasyon an, nou itilize paramèt mwayèn gwoup la pou presize modèl la, epi nou konsidere kalite selil yo nan mikwoanviwònman an kòm chak gwoup (n = 6 gwoup); pou tès siyifikasyon an, nou te fè twa mezi repete pou chak metabolit. Pou evite fo replikasyon, yo te enkli pasyan an kòm yon obstak nan konsepsyon limma a. Pou nou te kapab verifye diferans ki genyen nan metabolit ant diferan pasyan yo, nou te ajiste modèl limma a, enkli pasyan yo nan yon fason fiks. Nou rapòte siyifikasyon kontras pre-spesifye ant kalite selil la ak mikwoanviwònman Padj <0.05 (koreksyon Benjamini-Hochberg).
Apre anrichisman vigè a lè l sèvi avèk Twous Retire Selil Mò Miltenyi a (>80% viabilite), yo te fè sekans transkriptòm yon sèl selil sou total echantiyon asit ak timè vivan konjele yo lè l sèvi avèk yon pwotokòl ekspresyon jèn 10x 5′. Yo te analize senk ka ki gen timè ak asit ki koresponn, byenke viabilite ki ba nan yon echantiyon timè te anpeche enklizyon li. Pou nou te kapab chwazi plizyè pasyan, nou te konbine echantiyon chak pasyan nan liy kontwolè krom 10x la, epi nou te analize asit ak sit timè yo separeman. Apre sekans [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp pè bout (PE), jenòm Kebèk; yon mwayèn 73,488 ak 41,378 lekti pa selil pou timè ak asit respektivman]], nou te itilize CellSNP ak Vireo (53) (baze sou CellSNP kòm SNP imen komen (VCF) ki bay pa GRCh38 resevwa yon idantite donatè. Nou itilize SNPRelate pou dedwi idantite ki pi pre (IBS) nan estati jenotip pasyan an (IBS), eksepte selil ki pa asiyen ak selil ki idantifye kòm duplex ak donatè ki matche ant echantiyon asit ak timè (54). Sou baz travay sa a, nou te kenbe twa ka ki gen reprezantasyon selil abondan nan timè a ak asit pou analiz en. Apre nou fin fè yon etap filtraj mas nan anbalaj BioConductor scater (55) ak scran (56), sa te bay 6975 selil (2792 ak 4183 selil ki soti nan timè ak asit, respektivman) pou analiz. Nou itilize gwoupman Louvain igraph la (57) nan rezo vwazen ki pi pre pataje (SNN) ki baze sou distans Jaccard ak selil gwoupe pa ekspresyon. Gwoupman yo te manyèlman anote ak kalite selil swadizan ki baze sou ekspresyon jèn makè epi yo te vizyalize ak t-SNE. Selil T sitotoksik yo defini pa ekspresyon CD8A ak GZMA, eksepte sou-gwoupman ki gen ekspresyon pwoteyin ribozomal ki ba. Nou te jwenn aksè a done pibliye pa Izar et al. (16), ki gen ladan entegrasyon t-SNE yo, ka kontwole sipèpoze ekspresyon ant makè selil iminitè yo ak ekspresyon NNMT.
Yo te separe PBMC yo ak pwodui separasyon lekosit yo (STEMCELL Technologies) pa santrifijasyon dansite gradyan Ficoll. Yo te izole selil CD3+ yo nan PBMC lè l sèvi avèk pèl CD3 (Miltenyi). An prezans oswa absans MNA, yo te aktive selil CD3+ yo ak CD3 lye ak plak la (5μg/ml), CD28 idrosolubl (3μg/ml) ak IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Nan dènye jou ekspansyon an, yo te evalye viabilité a (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ak pwoliferasyon an (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) pa sitometri koule. Evalye fonksyon efèktè a lè w estimile selil yo ak PMA (20 ng/ml) ak iyonomisin (1μg/ml) ak GolgiStop pandan 4 èdtan, epi kontwole CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ak TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Estimile selil qPCR ak ChIP yo ak PMA (20 ng/ml) ak iyonomisin (1μg/ml) pandan 4 èdtan. Yo te kolekte sipènatant ELISA a anvan ak apre estimilasyon ak PMA (20 ng/ml) ak iyonomisin (1 μg/ml) pandan 4 èdtan.
Swiv pwotokòl manifakti a pou izole ARN lan lè l sèvi avèk RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Sèvi ak QIAshredder (QIAGEN) pou omojeneize echantiyon an. Sèvi ak twous ARN an ADNc ki gen gwo kapasite (Thermo Fisher Scientific) pou sentetize ADN konplemantè (ADNc). Sèvi ak TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) pou quantifye ekspresyon jèn (dapre pwotokòl manifakti a) avèk sond sa yo: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldeid-3-fosfat nan Idwojèn (GAPDH)] ak Hs01010726_m1 (SLC22A2). Yo te pase echantiyon yo sou sistèm PCR an tan reyèl StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) nan plak reyaksyon optik rapid 96-pi MicroAmp (Applied Biosystems) avèk fim optik MicroAmp. Nenpòt valè Ct ki depase 35 konsidere kòm pi wo pase papòt deteksyon an epi li make kòm endetektab.
Fè ChIP jan sa dekri deja (58). An brèf, selil yo te trete ak fòmaldeyid (konsantrasyon final 1.42%) epi yo te enkube yo nan tanperati chanm pandan 10 minit. Sèvi ak yon tanpon anfle siplemantè (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ak 0.1% NP-40) sou glas pandan 10 minit, answit resispann li nan tanpon imunoprecipitasyon jan sa dekri (58). Apre sa, echantiyon an te sonike ak sik sa yo: 10 sik (20 pulsasyon 1 segonn) ak yon tan estatik 40 segonn. Enkube antikò imunoglobulin G klas ChIP (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ak SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) ak echantiyon an nan 4°CC, souke yo pandan tout lannwit lan. Enkube pèl pwoteyin A yo (Thermo Fisher Scientific) avèk echantiyon an a 4°C avèk yon ti souke pandan 1 èdtan, answit sèvi ak pèl chelex (Bio-Rad) pou anrichi ADN nan, epi sèvi ak proteinaz K (Thermo Fisher) pou dijesyon pwoteyin nan. Yo te detekte pwomotè TNFα a pa PCR: pou pi devan, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; okontrè, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (pwodwi 207-bp). Imaj yo te pwodui pa Image Lab (Bio-Rad) epi yo te kantifye yo lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ.
Yo te kolekte sipènatant kilti selilè a jan sa dekri pi wo a. Yo te fè detèminasyon an dapre pwosedi manifakti a pou twous ELISA TNFα imen (Invitrogen), twous ELISA IL-2 imen (Invitrogen) ak twous ELISA IFN-γ imen (Abcam). Selon pwotokòl manifakti a, yo te dilye sipènatant la 1:100 pou detekte TNFα ak IL-2, epi 1:3 pou detekte IFN-γ. Sèvi ak EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) pou mezire absòbans lan nan 450 nm.
Yo te separe PBMC yo ak pwodui separasyon lekosit yo (STEMCELL Technologies) pa santrifijasyon dansite gradyan Ficoll. Yo te izole selil CD3+ yo nan PBMC lè l sèvi avèk pèl CD3 (Miltenyi). An prezans oswa absans MNA, yo te aktive selil CD3+ yo ak CD3 lye sou plak la (5μg/ml), CD28 idrosolubl (3μg/ml) ak IL-2 (300 U/ml; Proleukin) pandan 3 jou. Apre 3 jou, yo te kolekte selil yo epi yo te lave yo ak 0.9% saline, epi yo te konjele grenn nan rapidman. Yo te konte selil yo pa sitometri koule (Cytek Aurora; konfigirasyon 3L-16V-14B-8R) lè l sèvi avèk 123count eBeads.
Ekstrè metabolit yo jan sa dekri pi wo a. Ekstrè sèk la te rekonstitye nan yon konsantrasyon 4000 ekivalan selilè/μl. Analize echantiyon an pa kromatografi faz envèse (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ak kolòn CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, gwosè patikil 1.6-μm, gwosè pò 120-Å; #186008500, Waters). Espektwomèt mas polè (6470, Agilent), nan ki iyonizasyon elektwosprey opere nan mòd pozitif. Faz mobil A se 0.1% asid formik (nan H2O), faz mobil B se 90% asetonitril, 0.1% asid formik. Gradyan LC a se 0 a 2 minit pou 100% A, 2 a 7.1 minit pou 99% B, epi 7.1 a 8 minit pou 99% B. Apre sa, re-ekilibre kolòn nan ak faz mobil A nan yon vitès koule 0.6 ml/min pandan 3 minit. . Vitès koule a se 0.4ml/min, epi yo chofe chanm kolòn nan a 50°C. Sèvi ak estanda chimik pi MNA a (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) pou etabli tan retansyon (RT) ak transfòmasyon (RT = 0.882 minit, transfòmasyon 1 = 137→94.1, transfòmasyon 2 = 137→92, Konvèsyon 3 = 137→78). Lè twa tranzisyon yo rive nan tan retansyon ki kòrèk la, yo itilize tranzisyon 1 pou kantifikasyon pou asire espesifikite. Yo te pwodui koub estanda MNA a (Toronto Research Chemical Company) grasa sis dilisyon seri solisyon stock la (1 mg/ml) pou jwenn estanda 0.1, 1.0, 10 ak 100 ng/ml ak 1.0 ak 10μg/ml likid respektivman. Limit deteksyon an se 1 ng/ml, epi repons lineyè a se ant 10 ng/ml ak 10μg/ml. Yo itilize chak enjeksyon de mikrolit echantiyon ak estanda pou analiz LC/MS, epi yo fè yon echantiyon kontwòl kalite melanje chak uit enjeksyon pou asire estabilite platfòm analiz la. Repons MNA tout echantiyon selil trete ak MNA yo te nan limit lineyè tès la. Yo te fè analiz done yo lè l sèvi avèk lojisyèl analiz kantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Dezyèm jenerasyon konstriksyon αFR-CAR la te soti nan Song et al. (59). An brèf, konstriksyon an genyen kontni sa yo: sekans lidè CD8a, fragman varyab chèn sèl espesifik pou αFR imen, rejyon charnyèr ak transmembran CD8a, domèn entraselulè CD27 ak domèn entraselulè CD3z. Sekans CAR konplè a te sentetize pa GenScript, epi answit klone nan vektè ekspresyon lentiviral dezyèm jenerasyon an amont kasèt ekspresyon GFP ki te itilize pou evalye efikasite transdiksyon an.
Lentivirus la pwodui pa transfèksyon selil HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); yo grandi nan medyòm Dulbecco modifye Eagle ki gen 10% seròm fetal bovin (FBS) ak 1% PenStrep, epi yo te itilize vektè CAR-GFP epi plasmid anbalaj yo (psPAX2 ak pMD2.G, Addgene) itilize amin lipofèksyon (Sigma-Aldrich). Yo te kolekte sipènatant ki gen viris la 48 ak 72 èdtan apre transfèksyon an, yo te filtre l, epi yo te konsantre l pa ultrasantrifijasyon. Yo te konsève sipènatant viral konsantre a a -80°C jiskaske transdiksyon an fèt.
Yo separe PBMC yo ak pwodui separasyon lekosit donatè ki an sante yo (STEMCELL Technologies) pa santrifijasyon dansite gradyan Ficoll. Sèvi ak mikwo-pèl CD8 seleksyon pozitif (Miltenyi) pou izole selil CD8+ yo nan PBMC. Stimile selil T yo ak TransAct (Miltenyi) epi nan medyòm TexMACS [Miltenyi; complété ak 3% serom imen inaktif pa chalè, 1% PenStrep ak IL-2 (300 U/ml)]. Vennkat èdtan apre estimilasyon an, yo te transdi selil T yo ak lentivirus (10 μl sipènatant viris konsantre pou chak 106 selil). 1 a 3 jou apre transdiksyon sou Cytek Aurora (sou FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evalye ekspresyon GFP selil yo pou demontre yon efikasite transdiksyon omwen 30%.
Selil CAR-T yo te kiltive pandan 24 èdtan nan Immunocult (STEMCELL Technologies; complété ak 1% PenStrep) nan kondisyon sa yo: san tretman, trete ak 250 μM adenozin oswa 10 mM MNA. Apre pretretman an, selil CAR-T yo te lave ak PBS epi konbine avèk 20,000 selil SK-OV-3 [ATCC; nan mwayen McCoy 5A (Sigma-Aldrich) complété ak 10% FBS ak 1% PenStrep nan 10: Rapò efèktè/sib 1 an te anplifye an triplikat nan mwayen Immunocult complété. Selil SK-OV-3 ak selil SK-OV-3 lize ak saponin dijital (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) yo te itilize kòm kontwòl negatif ak pozitif, respektivman. Apre 24 èdtan ko-kiltivasyon, yo te kolekte sipènatant la epi yo te mezire laktat dezidrogenaz (LDH) la dapre enstriksyon manifakti a (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Yo te dilye sipènatant LDH la 1:50 nan tanpon LDH. Yo te mezire pousantaj eliminasyon an lè l sèvi avèk fòmil sa a: pousantaj eliminasyon = pousantaj koreksyon / to maksimòm eliminasyon x 100%, kote pousantaj koreksyon = ko-kilti-selil T sèlman, epi to maksimòm eliminasyon = kontwòl pozitif-kontwòl negatif.
Jan sa dekri nan tèks la oswa materyèl ak metòd yo, sèvi ak GraphPad Prism 8, Microsoft Excel oswa R v3.6.0 pou analiz estatistik la. Si plizyè echantiyon yo kolekte nan menm pasyan an (tankou asit ak timè), nou itilize yon tès t pè oswa nou enkli pasyan an kòm yon efè o aza nan yon modèl lineyè oswa jeneralize jan sa apwopriye. Pou analiz metabolomik, tès enpòtans lan fèt an triplika.
Pou plis materyèl pou atik sa a, tanpri gade http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Sa a se yon atik aksè ouvè distribye anba kondisyon Lisans Atribisyon-Non-Komèsyal Creative Commons lan, ki pèmèt itilizasyon, distribisyon ak repwodiksyon nan nenpòt mwayen, depi itilizasyon final la pa pou benefis komèsyal epi prensip la se ke travay orijinal la kòrèk. Referans.
Nòt: Nou sèlman mande w pou w bay adrès imel ou pou moun ou rekòmande sou paj la ka konnen ou vle yo wè imel la epi li pa spam. Nou p ap pran okenn adrès imel.
Kesyon sa a sèvi pou teste si ou se yon vizitè epi pou anpeche soumèt spam otomatik.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini DeRusell Jones (Ralph J. De Bellardini DeRussell Jones) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA kontribye nan sipresyon iminitè selil T yo epi li reprezante yon sib iminoterapi potansyèl pou tretman kansè imen.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini DeRusell Jones (Ralph J. De Bellardini DeRussell Jones) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA kontribye nan sipresyon iminitè selil T yo epi li reprezante yon sib iminoterapi potansyèl pou tretman kansè imen.
©2021 Asosyasyon Ameriken pou Avansman Syans. tout dwa rezève. AAAS se yon patnè HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ak COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.