Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa gen sipò limite pou CSS. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript.
Kontrèman ak vètebre yo, yo panse anpil ensèk pa gen òmòn esteroyid sèks ki gen patipri gason. Nan Anopheles gambiae, esteroyid ekdizòn 20-idwoksiekdizòn (20E) a sanble evolye pou kontwole devlopman ze lè fi yo sentetize li2 epi pou pwovoke yon peryòd refraktè kwazman lè mal yo transfere li seksyèlman3. Piske devlopman ze ak kwazman se karakteristik repwodiktif esansyèl, konprann kijan moustik Anopheles fi yo entegre siyal ormonal sa yo ta ka fasilite konsepsyon nouvo pwogram kontwòl malarya. La a, nou revele ke fonksyon repwodiktif sa yo reglemante pa esteroyid sèks diferan atravè yon rezo konplèks anzim ki aktive/dezaktive ekdisteroid. Nou idantifye yon ekdizòn oksidize espesifik pou gason, 3-deidro-20E (3D20E), ki pwoteje parantaj lè li fèmen reseptivite seksyèl fi apre transfè seksyèl ak aktivasyon pa defosforilasyon. Li enpòtan pou note ke transfè 3D20E a te pwovoke tou ekspresyon jèn repwodiktif ki kenbe devlopman ze pandan enfeksyon Plasmodium, pou asire sante fi ki enfekte yo. 20E ki sòti nan fi a pa pwovoke yon peryòd repwodiktif seksyèl. repons, men li pèmèt moun ki ap kwaze ponn ze apre kinaz ki inibi 20E yo fin inibi. Idantifikasyon òmòn esteroyid ensèk espesifik pou gason sa a ak wòl li nan reglemante reseptivite seksyèl fi yo, fètilite ak entèraksyon ak Plasmodium sijere potansyèl pou diminye siksè repwodiktif moustik ki transmèt malarya.
Ka malarya ak lanmò yo ap ogmante ankò4 akòz rezistans jeneralize nan moustik Anopheles yo, sèl vektè parazit malarya imen yo. Byoloji kwazman moustik sa yo se yon sib patikilyèman atiran pou nouvo entèvansyon kontwòl malarya paske femèl yo sèlman kwaze yon fwa5; fè evènman kwazman inik sa a esteril ta gen yon gwo potansyèl pou diminye popilasyon moustik yo nan jaden an.
Medam yo vin enfim seksyèlman apre yo fin resevwa òmòn esteroyid ki gen gwo tit nan men gason. Etid yo montre ke deklanchè difikilte pou plis kwazman se 20-idwoksiekdizòn (20E), yon òmòn esteroyid ke yo konnen pi byen kòm yon regilatè sik mue a nan etap lav la. Kapasite mal yo pou sentetize ak transfere 20E evolye espesyalman nan espès Anopheles ki fè pati sou-jen Cellia7 la, ki distribye ann Afrik epi ki gen ladan vektè malarya ki pi danjere yo, tankou Anopheles gambiae. Sa a patikilyèman remakab paske nan espès sa yo, femèl yo pwodui 20E tou apre chak repa san, epi 20E kondwi sik oojenèz la (gade ref. 8). Sepandan, yo pa konnen anpil sou fason femèl yo entegre siyal ki soti nan de sous diferan ekdizòn (transfè mal ak endiksyon manje san) san yo pa konpwomèt pwòp kapasite yo pou kwaze. Anfèt, si 20E femèl yo pwodui a deklanche entolerans seksyèl, sa ap mennen nan esterilite nan moun ki vyèj k ap manje, yon konpòtman trè komen nan moustik sa yo5.
Yon eksplikasyon posib se ke mal A. gambiae yo transfere yon ekdizòn espesifik pou mal ki modifye, ki aktive yon kaskad siyal nan aparèy repwodiktif fi a, sa ki lakòz enstabilite kwazman. Sepandan, byenke vètebre yo gen plizyè òmòn esteroyid, tankou estwojèn ak androjèn (revize nan ref. 9), nan konesans nou, yo pa idantifye estewoyid ki gen patipri androjèn nan ensèk.
Nou te deside detèmine repètwa òmòn esteroyid ki nan glann akseswa gason (MAG) A. gambiae ki gen matirite seksyèl pou chèche posib esteroyid modifye. Lè nou te itilize kromatografi likid pèfòmans segondè makonnen ak espektwometri mas tandem (HPLC-MS/MS) olye de metòd mwens espesifik nou te itilize anvan an, nou te detekte ekdizòn (E) ak 20E nan tisi sa a, sa ki konfime rezilta anvan an. Sepandan, echantiyon an te domine pa esteroyid fosforile oksidize, ki konsistan avèk fòmil 3-deidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Figi 1). Lòt fòm yo enkli 3-deidro-20E (3D20E) ak 20E-22-fosfat (20E22P). Entansite siyal HPLC-MS/MS 3D20E22P a te de lòd mayitid pi wo pase fòm defosforile li a, 3D20E, ak twa lòd mayitid pi wo pase sa E ak 20E (Figi 1). Malgre ke nan lòt pati nan kò a ak nan pati ki pi ba a aparèy repwodiktif (LRT; Done Elaji Fig. 1a). Nou te analize tou ekdisteroid nan mal ak fi ki fèk fèmen (<1 jou) epi nou te detekte 3D20E ak 3D20E22P sèlman nan MAG; E, 20E ak 20E22P te prezan nan tou de sèks yo (Done Elaji Fig. 1b). Done sa yo sijere ke mal adilt A. gambiae yo pwodui gwo tit òmòn modifye nan MAG yo ke fi yo pa sentetize.
Yo te disseke MAG ak LRT fi (ki gen ladan atria, vezikil seminal, ak parovarium) nan men gason vyèj ki gen 4 jou (4 jou) ak fi vyèj ak fi ki kwaze (0.5, 3, ak 12 hpm). Yo te analize ekdizòn nan tisi sa yo pa HPLC-MS/MS (mwayèn ± sem; tès t ki pa pè, bilateral, korije to dekouvèt fo (FDR); NS, pa siyifikatif; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 èdtan vs. 0.5 èdtan, P = 0.035; 12 èdtan vs. 3 èdtan, P = 0.0015; 12 èdtan vs. 0.5 èdtan, P = 0.030. 3D20E22P: 3 èdtan vs. 0.5 èdtan, P = 0.25; 12 èdtan vs. 3 èdtan, P = 0.0032; 12 èdtan vs. 0.5 èdtan, P = 0.015). Done yo soti nan twa replikasyon byolojik. Yo te kalkile zòn pik la pou chak ekdizòn ki enterese yo epi yo te normalize l pa kantite moustik. Ekdizòn reprezante pa koulè jan sa a: E, vèt; 20E, zoranj; 20E22P, koulè mov; 3D20E, ble; 3D20E22P, woz. Desen anndan an ogmante echèl la sou aks y la pou montre nivo ekdizòn ki pi ba yo.
Pou nou te mennen ankèt sou si 3D20E22P ak 3D20E yo transfere pandan kwazman, nou te disseke LRT fi yo nan divès moman apre kwazman. Malgre ke nou pa t jwenn ekdizòn nan vyèj yo, nou te obsève kantite sibstansyèl 3D20E22P nan LRT a imedyatman apre kwazman (0.5 èdtan apre kwazman, hpm), li te diminye sou tan, pandan ke nivo 3D20E yo te ogmante anpil (Fig. 1). Lè nou te itilize 3D20E sentetize chimikman kòm yon estanda, nou te detèmine ke nivo òmòn esteroyid sa a nan LRT pandan kwazman yo te omwen 100 fwa pi wo pase 20E (Tablo Done Elaji 1). Kidonk, 3D20E22P se prensipal ekdizòn gason ki transfere nan LRT fi a pandan kwazman, epi fòm defosforile li a, 3D20E, vin trè abondan yon ti tan apre kwazman. Sa sijere yon wòl enpòtan pou dènye ekdizòn nan byoloji apre kwazman fi a.
Apre nou te fin jenere yon nouvo seri done sekans ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), lè l sèvi avèk yon tiyo byoenformatik ki fèt espesyalman pou nou, nou te chèche kinaz ekdizòn (EcK), oksidaz ekdizòn (EO), ak ekdizòn ki kode jèn fosfataz modifye 20E a. EPP) eksprime nan tisi repwodiktif yo. Nou te idantifye yon jèn EPP kandida ak de jèn EcK potansyèl (EcK1 ak EcK2), men nou pa t kapab jwenn yon bon jèn EO kandida. Li enpòtan pou note ke jèn EPP endividyèl yo te eksprime nan nivo ki wo (98.9yèm persentil) nan MAG ganbyen yo men pa nan LRT fi yo (Fig. 2b), kontrèman ak sa nou te espere piske defosforilasyon 3D20E22P te fèt nan tisi fi sa a. Se poutèt sa, nou kwè ke EPP gason an ka transfere pandan kwazman. Anfèt, nou te itilize etikèt izotòp ki estab in vivo pou maske pwoteyin fi a apre kwazman, yon anzim idantifye pa MS nan atriyòm fi a (Fig. 2c ak Tablo Siplemantè 1). Yo te konfime tou prezans EPP nan MAG ak LRT fi ki te kwaze (men pa vyèj) lè l sèvi avèk antikò espesifik (Fig. 2d).
a, Yon tiyo byoenformatik ki fèt espesyalman pou chèche jèn ki kode EcK, EO, ak EPP nan tisi repwodiktif chak sèks. Nimewo ki akote flèch yo endike kantite kandida gason ak fi nan chak etap. Analiz sa a idantifye yon jèn EPP (EPP) ak yon jèn EcK (EcK1) ki eksprime nan gason, ak yon jèn EcK (EcK2) ki eksprime nan tou de sèks men ki pa bay yon jèn EO kandida. b, Kat chalè ki konpare ekspresyon jèn kandida nan tisi Anopheles gambiae ak Anopheles albicans vyèj (V) ak k ap kwaze (M). Spca, fekondasyon; MAG, glann akseswa nan gason; lòt pati nan kò a, tankou tete, zèl, janm, kò gra, ak ògàn entèn nan tou de sèks, ak ovè nan fi yo. EcK2 trè eksprime nan tou de MAG ak atria Gambia, tandiske EPP yo jwenn sèlman nan MAG. c, Analiz pwoteyomik translokasyon gwoup ejakulasyon gason nan atria fi a 3, 12 ak 24 hpm, ki montre 67 pwoteyin ki pi abondan yo. Fi yo te elve sou yon rejim alimantè ki gen 15N pou make (epi maske) tout pwoteyin yo. Gason ki pa make yo te kwaze ak fi ki make, epi LRT fi yo te disseke a 3, 12 ak 24 hpm pou analiz pwoteyomik (gade Tablo Siplemantè 1 pou yon lis konplè pwoteyin ejakulatwa). Ankadreman, EPP, Eck1 ak EcK2 yo te detekte nan MAG gason vyèj yo pa analiz pwoteyomik tisi sa yo. d, EPP te detekte pa western blot nan MAG ak LRT fi kwaze, men pa nan fi vyèj oswa gason oswa rès fi a. kò. Manbràn yo te sonde an menm tan ak antikò anti-aktin (kontwòl chaj) ak antikò anti-EPP. Tout gason yo se vyèj. Gade Figi Siplemantè 1 pou done sous jèl la. Western blots yo te fèt de fwa ak rezilta menm jan an.
Aktivite fosfofosfataz ekdisteroid EPP a te verifye apre enkubasyon pa HPLC-MS/MS ak 3D20E22P izole nan MAG (Done Elaji Fig. 2a). Anplis de sa, lè nou te silansye EPP pa entèferans medyatè ARN (RNAi), nou te detekte yon gwo rediksyon nan aktivite fosfataz nan tisi repwodiktif mal sa yo (Fig. 3a), epi fi ki te kwaze ak mal ki te silansye EPP yo te montre yon pwopòsyon siyifikatif ki pi ba nan 3D20E defosforile (Fig. 3b) malgre silansyasyon jèn pasyèl (Done Elaji Fig. 2b,c). Okontrè, nou pa t detekte chanjman siyifikatif nan rapò 20E22P/20E nan menm moustik yo, sa ki ta ka sijere ke anzim lan espesifik pou 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Diminisyon aktivite fosfataz nan MAG ki koze pa silansyasyon EPP lè l sèvi avèk kontwòl ARN EPP doub-chèn (dsEPP) oswa ARN GFP doub-chèn (dsGFP). Yo te itilize ven pisin MAG nan chak replikasyon (P = 0.0046, tès-t pè, de bò), reprezante pa pwen separe.b, Fi ki kwaze ak gason ki te silanse ak EPP yo te gen yon pwopòsyon siyifikativman pi ba nan 3D20E defosforile a 3 hpm (P = 0.0043, tès-t san pè, de bò), alòske nivo 20E yo pa te afekte (P = 0.063, san pè). tès-t, bilateral). Done yo prezante kòm mwayèn ± sem ki soti nan twa pisin ki gen 13, 16 ak 19 fi chak.c, Fi ki te kwaze ak mal ki te gen silans EPP te gen yon pousantaj re-kwazman ki pi wo anpil (P = 0.0002, tès egzak Fisher a, bilateral). Yo te premye fòse fi yo kwaze pou asire estati kwazman yo; 2 jou apre, yo te kontakte lòt mal ki te gen espèm transjenik pou evalye to re-kwazman yo grasa deteksyon PCR kantitatif transjèn nan.d, Fi ki te manje san epi ki te kwaze ak mal ki pa t gen EPP sou kote yo te fè sèks te gen yon fètilite ki te redwi anpil (P < 0.0001; tès Mann-Whitney, bilateral) epi yon kantite ze te yon ti jan redwi (P = 0.088, tès Mann-Whitney, bilateral), alòske to ponn lan pa t afekte (P = 0.94, tès egzak Fisher a, bilateral).Nan tout panno yo, n reprezante kantite echantiyon moustik ki gen yon biyolojik endepandans.NS, pa siyifikatif.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Apre sa, nou te evalye si defosforilasyon ekdizon enpòtan pou pwovoke rezistans kwazman lakay femèl yo. Li enpòtan pou note ke femèl ki te kwaze ak mal ki pa gen ase EPP te kwaze ankò nan yon frekans pi wo (44.9%) pase femèl kontwòl yo (10.4%) lè yo te ekspoze a lòt mal (transjenik) (Fig. 3c). Nou te obsève tou yon diminisyon siyifikatif nan fètilite (Fig. 3d, agoch) ak yon ti diminisyon nan kantite ze femèl sa yo te ponde (Fig. 3d, mitan), alòske pousantaj ze femèl yo te ponde (yon lòt repons ki pwovoke lakay femèl yo pandan kwazman)) pa te afekte (Fig. 3d, adwat). Etandone espesifikite EPP ki obsève a pou 3D20E22P, rezilta sa yo sijere ke aktivasyon 3D20E pa EPP ki transfere pandan kwazman an ka gen yon wòl enpòtan nan fèmen reseptivite femèl yo pou plis kwazman, yon konpòtman yo te deja atribiye a transfè seksyèl 20E a. Se poutèt sa, òmòn espesifik gason sa a afekte fètilite femèl tou fòtman.
Apre sa, nou te konpare aktivite 20E ak 3D20E nan eksperyans enjeksyon nan vyèj ki gen matirite seksyèl lè nou te itilize 3D20E sentetize chimikman (Fig. 4a-c) ak 20E ki disponib nan komès. Nou te obsève ke 3D20E te siyifikativman pi efikas pase 20E nan fèmen sansiblite fi yo nan kwazman nan tou de konsantrasyon yo (Fig. 4d). Li enpòtan pou note ke mwatye nivo fizyolojik 3D20E nan LRT a (1,066 pg apre enjeksyon vs. 2,022 pg apre kwazman) te pwovoke yon pwopòsyon fi refraktè ki te 20 fwa pi wo pase nivo fizyolojik 20E a (361 pg apre enjeksyon) 24 èdtan apre enjeksyon an nan pi gwo konsantrasyon an 18 pg apre kwazman; Tablo Done Elaji 1). Rezilta sa a konsistan avèk nosyon ke transfè seksyèl 20E a pa lakòz peryòd refraktè kwazman, epi li plis montre 3D20E kòm yon faktè enpòtan nan asire relasyon paran-pitit. 3D20E te tou siyifikativman pi aktif pase 20E nan tès ponn ze nan femèl vyèj (Fig. 4e), sa ki sijere ke to ponn ze nòmal nou obsève apre silansyasyon pasyèl EPP a te akòz prezans aktivite rezidyèl 3D20E ki toujou pwodui pa faktè femèl pwovoke pa kwazman.
(a,b) 3D20E sentetize chimikman apati 20E (a) avèk yon konvèsyon/efikasite ki wo anpil (done yo prezante kòm mwayèn ± sem ki soti nan twa reyaksyon sentèz endepandan) (b).c, Espèk mas (mwatye anba a) koresponn egzakteman ak ekdizòn yo jwenn nan LRT fi ki kwaze (mwatye anwo).d, Konpare ak 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; tès egzak Fisher a, de bò) ak 10% etanòl (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; tès egzak Fisher a, de bò), pandan ke 20E te siyifikativman pi wo pase kontwòl la sèlman nan dòz ki pi wo yo (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; tès egzak Fisher a, de bò).e, 3D20E Enjeksyon an te pwovoke yon to repwodiksyon siyifikativman pi wo nan fi vyèj pase kontwòl 10% etanòl (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; tès egzak Fisher a, bilateral), pandan ke 20E konpare ak kontwòl yo sèlman nan dòz ki pi wo (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; tès egzak Fisher a, bilateral). 3D20E te pwovoke yon to repwodiksyon siyifikativman pi wo pase 20E nan dòz ki pi wo (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; tès egzak Fisher a, bilateral). Nan tout panèl yo, n reprezante kantite echantiyon moustik byolojikman endepandan. NS, pa siyifikatif. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Done yo soti nan twa replikasyon.
Nan etid anvan yo, nou te detèmine ke transfè seksyèl òmòn esteroyid yo pwovoke ekspresyon MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), yon jèn repwodiktif fi ki pwoteje fi A. gambiae kont enfeksyon P. falciparum. Pri sante ki koze pa 13, parazit malarya imen ki pi mòtèl la. Etandone enpòtans MISO pou kapasite repwodiktif Anopheles nan zòn ki andemik malarya, nou te deside detèmine ki òmòn 3D20E oswa 20E ki deklanche ekspresyon jèn sa a. Nou te jwenn ke pandan ke enjeksyon 20E a te pwovoke espesyalman oswa plis puisanman kèk reseptè òmòn nikleyè (HR), tankou HR3 ak HR4, ak sib esteroyid tipik an aval, tankou jèn yolkojenik Vg14, 15, 16 yo, MISO te pwovoke pi fòtman pa 3D20E (Done Pwolonje Fig. 3). Kidonk, transfè seksyèl òmòn esteroyid androjenik sa a sanble pwovoke mekanis ki pwoteje fi yo kont depans enfeksyon parazit la poze. Anplis de sa, 3D20E afekte diferan fason tou de izofòm reseptè EcR a, ki pwovoke EcR-A epi ki reprime EcR-B, epi ki deklanche plis lòt jèn ki pwovoke kwazman, tankou HPX15, ki afekte fètilite fi. Sa a ta ka eksplike gwo lakòz esterilite yo obsève nan fi ki kwaze ak gason ki pa gen EPP (Done Elaji Fig. 3). Done sa yo sijere egzistans chemen en aval ki aktive preferansyèlman pa de òmòn ekdizòn ki ta ka soutni fonksyon espesifik sèks la.
Apre sa, nou te teste fonksyon de jèn EcK yo idantifye nan pwosesis byoenformatik nou an. Silansman EcK1 oswa EcK2 te lakòz yon mòtalite siyifikatif nan gason yo (Done Elaji Fig. 4a), sa ki sijere ke fosforilasyon ekdizòn, e konsa inaktivasyon, enpòtan pou siviv. Paske EcK2 te eksprime nan nivo ki pi wo pase EcK1 epi li te detekte nan MAG pa pwoteyomik (Fig. 2b,c ak Tablo Siplemantè 2), nou te valide aktivite kinaz ekdisteroid li lè nou te enkube li ak 20E, sa ki te lakòz fosforilasyon 20E22P (Done Elaji Figi 2).4b). Lè nou te itilize 3D20E kòm yon substra, nou pa t kapab detekte pwodui fosforile 3D20E22P a (Done Elaji Fig. 4c), sa ki sijere ke 20E olye de 3D20E ta ka sib prefere EcK2 a.
Dapre analiz RNA-seq nou an, EcK2 te trè eksprime tou nan LRT fi vyèj yo, kote li te etenn apre kwazman (Fig. 2b). Nou te konfime done sa yo epi nou te detèmine ke ekspresyon EcK2 pa te afekte pa manje san (Done Elaji Fig. 5a). Lè nou te pwolonje premye eksperyans MS nou yo, nou te detèmine ke pik 20E22P a te gen yon relasyon sere avèk pik 20E a (22-26 èdtan apre repa san; Done Elaji Fig. 5b). Silansman EcK2 nan fi vyèj yo te lakòz yon ogmantasyon 3 fwa nan rapò relatif 20E ak 20E22P a 26 èdtan apre repa san (Done Elaji Figi 2c ak 5c), sa ki konfime ke EcK2 fosforile 20E tou nan fi yo. Li enpòtan pou note ke fi vyèj ki pa gen ase EcK2 te kenbe tout reseptivite seksyèl yo (Done Elaji Fig. 5d,e), sa ki sijere plis ke pwodiksyon fi 20E pa pwovoke peryòd refraktè kwazman. Sepandan, fi sa yo te genyen... te siyifikativman ogmante to ponn ze konpare ak kontwòl yo, ak plis pase 30% nan vyèj yo ki te ponn ze (Done Elaji Fig. 5f). Si yo te fè piki ARN Eck2 doub-chèn (dsEcK2) apre yo te fin manje san, ponn pa t fèt, nan pwen sa a pik 20E akòz enjèstyon san an te diminye. An jeneral, rezilta sa yo sipòte yon modèl ki di ke 20E ki pwodui apre souse san ka pwovoke ponn, men sèlman lè blòk ponn lan (EcK2 ak petèt lòt faktè) etenn pa kwazman. Ni piki 20E ni piki 3D20E pa t inibi ekspresyon EcK2 nan vyèj yo (Done Elaji Fig. 5g), ki sijere ke lòt faktè medyatè inibisyon kinaz sa a. Sepandan, nivo 20E apre yo te fin manje san pa t ase pou pwovoke malèz kwazman, men yo te efektivman deklanche pa gwo tit 3D20E transfere seksyèlman.
Rezilta nou yo bay enfòmasyon enpòtan sou mekanis ki kontwole siksè repwodiktif A. gambiae. Yon modèl parèt kote mal yo evolye pou sentetize gwo tit 3D20E, yon ekdizòn modifye espesifik pou mal ki asire paran yo lè yo desensibilize fi yo pou plis kwazman. An menm tan, vektè malarya sa yo te devlope tou yon sistèm efikas pou aktive 3D20E nan fi an repons a transfè seksyèl EPP espesifik pou mal. Nan konesans nou, sa a se premye egzanp yon sistèm òmòn esteroyid domine pa gason ak fi ki fè yon fonksyon inik ak kritik nan ensèk yo. Fonksyon ekdizòn espesifik pou mal yo te postule men yo pa demontre li definitifman. Pa egzanp, yon ipotèz 18 ki lajman demanti se ke fonksyon sa yo ka fèt pa prekisè 20E E1 la. Li byen koni ke nan Drosophila, monandri deklanche pa transfè seksyèl ti peptid sèks 19,20 ki kominike avèk newòn ki inève aparèy repwodiktif fi a atravè reseptè peptid sèks espesifik 21,22. Plis travay nesesè pou detèmine kaskad siyalizasyon en yo. kontwole pa 3D20E nan fi A. gambiae epi pou detèmine si kaskad sa yo ka konsève ant moustik ak Drosophila.
Etandone wòl enpòtan 3D20E sou fètilite ak konpòtman fi yo idantifye nan etid nou an, chemen ki mennen nan sentèz ak aktivasyon 3D20E yo ofri nouvo opòtinite pou estrateji kontwòl moustik nan lavni, tankou jenerasyon mal esteril konpetitif nan estrateji teknoloji ensèk esteril yo. Itilize pou lage nan bwa oswa pou imite 3D20E nan jwèt vyèj. Fonksyon espesifik pou gason 3D20E a te ka evolye lè A. gambiae ak lòt espès Cellia te akeri kapasite pou koagule espèm yo nan bouchon kwazman, paske sa pèmèt transfè efikas yon gwo kantite òmòn ak anzim ki aktive òmòn. An retou, evolisyon 3D20E ki aplike monandri bay yon mekanis pou fi yo (atravè gwo ekspresyon MISO) pou favorize kapasite repwodiktif yo nan zòn ki gen gwo prevalans malarya, ki kontribye endirèkteman nan transmisyon Plasmodium. Etandone ke yo te montre ke 20E fi a gen efè pwofon sou siviv ak kwasans P. falciparum nan moustik Anopheles fi yo,24 tou de chemen òmòn esteroyid gason ak fi yo kounye a se aspè kle nan entèraksyon moustik-parazit.
Yo te elve souch A. gambiae G3 nan kondisyon estanda pou ensèk (26-28 °C, 65-80% imidite relatif, fotoperyòd limyè/fènwa 12:12 èdtan). Yo te bay lav yo manje pwason an poud (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ak Tetra Pond Sticks nan yon rapò 7:7:2). Yo te bay moustik adilt yo solisyon dekstròz 10% ad libitum ak san moun chak semèn (etidye konpozan san yo). Yo te jwenn moustik vyèj lè yo te separe sèks yo nan etap krizalid apre yo te fin egzamine pwent yo pa mikwoskopi. Yo te dekri mal ki pote transjèn DsRed la deja.
Eksperyans kwazman fòse yo te fèt dapre pwotokòl ki te dekri deja. Pou kwazman natirèl, yo te kenbe fi vyèj ki gen 4 jou nan yon rapò 1:3 ak mal vyèj ki gen matirite seksyèl pandan de nwit. Pou eksperyans kote yo te enjekte mal yo ak dsEPP, ko-kaj la te koresponn ak jou 3-4 apre enjeksyon an, lè aktivite fosfataz la te silansye nèt (Done Pwolonje Fig. 2b).
Yo te disseke tisi moustik yo, kadav ki rete yo (rès kò a), oswa tout kò a nan 100% metanòl epi yo te omojeneize yo ak yon zouti pou mete pèl (pèl an vè 2 mm, 2,400 rpm, 90 seg). Kantite tisi ak volim metanòl yo te jan sa a: rès kò a, 50 nan 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT fi, 25–50 80 µl. Yo te sibi presipite a nan yon dezyèm ekstraksyon metanòl ak menm volim metanòl la. Yo te retire debri selilè yo pa santrifijasyon. Yo te konbine metanòl ki soti nan tou de ekstraksyon yo epi yo te seche l anba yon koule azòt, answit yo te resispann li nan volim sa yo ki gen 80% metanòl nan dlo: rès kò a, 50 µl; MAG ak LRT fi, 30 µl.
Yo te analize echantiyon yo sou yon espektwomèt mas (ID-X, Thermo Fisher) konekte ak yon enstriman LC (Vanquish, Thermo Fisher). Yo te enjekte 5 µl echantiyon sou yon kolòn 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) ki te kenbe a 25 °C. Faz mobil yo pou LC a se te A (dlo, 0.1% asid formik) ak B (asetonitril, 0.1% asid formik). Gradyan LC a te jan sa a: 5% B pandan 1 minit, answit ogmante a 100% B pandan 11 minit. Apre 8 minit a 100%, re-ekilibre kolòn nan a 5% B pandan 4 minit. Debi a te 0.3 ml min-1. Ionizasyon nan sous MS la reyalize pa ionizasyon elektwoespre chofe nan mòd pozitif ak negatif.
Espektwomèt mas la mezire done nan seri m/z soti nan 350 a 680 nan yon rezolisyon 60,000 nan mòd MS konplè. Done MS/MS yo te jwenn sou [M + H]+ (tout sib), [M - H2O + H]+ (tout sib), ak [M - H]- (sib fosforile). Done MS/MS yo te itilize pou konfime pwopriyete ekdizòn sib pou ki pa te gen okenn estanda ki disponib. Pou idantifye ekdisteroid ki pa sib yo, done MS/MS pou tout pik HPLC ki gen plis pase 15% abondans relatif yo te analize. Kantifye lè l sèvi avèk koub estanda ki kreye apati estanda pi (20E, 3D20E) pou kalkile kantite absoli oswa dilisyon yon echantiyon espesifik (tout lòt sib) pou kalkile ekivalans yo ak kantite yo te jwenn nan yon gason. Pou 3D20E, kantifikasyon an te fèt lè l sèvi avèk sòm adui sa yo: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Yo te ekstrè done yo epi kantifye yo lè l sèvi avèk Tracefinder (vèsyon 4.1). Yo te analize done MS/MS yo lè l sèvi avèk Xcalibur (vèsyon 4.4). Yo te konpare spèk MS E, 20E ak 3D20E yo ak estanda respektif yo. Yo te analize 3D20E22P pa derivatizasyon ak reyaktif Girard la. Yo te analize 20E22P pa rapò m/z.
Yo te pirifye 3D20E22P a soti nan MAG. Yo te fè pirifikasyon an sou yon echèl analitik lè l sèvi avèk yon kromatograf likid ultra-pèfòmans (Acquity, Waters) avèk yon detektè ki baze sou mas kwadripòl (QDa, Acquity, Waters) anba menm kondisyon LC ak analiz HPLC-MS/MS la. Yo te deklanche koleksyon fraksyon an lè yo te detekte m/z ki koresponn ak 3D20E22P a nan menm tan retansyon an jan yo te detèmine anvan an. Apre sa, yo te verifye pite konpoze yo te ekstrè yo pa HPLC-MS/MS jan sa dekri pi wo a.
Yo te ekstrè ARN total nan 10-12 tisi repwodiktif oswa lòt pati nan kò a (san tèt) lè l sèvi avèk reyaktif TRI (Thermo Fisher) swivan enstriksyon manifakti a. Yo te trete ARN ak TURBO DNase (Thermo Fisher). Yo te sentetize ADNc a lè l sèvi avèk transcriptase envès viris lesemi murin Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) swivan enstriksyon manifakti a. Yo te pibliye deja primè pou PCR kantitatif transkripsyon envès (RT-qPCR; Tablo Done Ekstansyon 2)24 oswa yo te konsevwa lè l sèvi avèk Primer-BLAST26, ak preferans yo te bay pwodwi ki gen yon gwosè 70-150 bp epi ki kouvri jonksyon exon-exon oswa primè pè Primer exon separe. Yo te dilye echantiyon ADNc ki soti nan twa a kat replikasyon byolojik kat fwa nan dlo pou RT-qPCR. Yo te fè kantifikasyon nan reyaksyon replikasyon 15 µl ki gen 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primè, ak 5 µl ADNc dilye. Yo te fè reyaksyon yo sou yon QuantStudio 6 Pro. Sistèm PCR an tan reyèl (Thermo Fisher) epi done yo te kolekte epi analize lè l sèvi avèk Design and Analysis (vèsyon 2.4.3). Jan etid sa a demontre, kantite relatif yo te nòmalize ak jèn ribozomal RpL19 (AGAP004422) la, ki gen ekspresyon pa t chanje anpil lè yo te bay san 27 oswa lè yo te kwaze 3.
Yo te verifye kalite ARN lan avèk yon Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Yo te prepare epi egzekite bibliyotèk Illumina pè-bout yo nan Broad Institute of MIT ak Harvard. Yo te aliyen lekti sekans yo ak jenòm A. gambiae a (souch PEST, vèsyon 4.12) lè l sèvi avèk HISAT2 (vèsyon 2.0.5) avèk paramèt default. Yo te retire lekti ki gen nòt kalite map (MAPQ) <30 lè l sèvi avèk Samtools (vèsyon 1.3.1). Yo te konte kantite lekti ki mape ak jèn yo lè l sèvi avèk htseq-count (vèsyon 0.9.1) avèk paramèt default. Yo te kalkile kantite lekti nòmalize yo epi yo te analize ekspresyon jèn diferansyèl la lè l sèvi avèk pake DESeq2 (vèsyon 1.28.1) nan R (vèsyon 4.0.3).
Yo te idantifye kandida jèn ki modifye ekdisòn yo lè yo te premye fè rechèch nan jenòm A. gambiae a avèk algorithm PSI-BLAST la (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), lè yo te itilize valè paramèt default ak sekans pwoteyin rechèch sa yo: soti nan Bombyx mori (Nimewo Aksè NP_001038956.1), Musca domestica (Nimewo Aksè XP_005182020.1, XP_005175332.1 ak XP_011294434.1) ak Microplitis demolitor (Nimewo Aksè XP_008552646.1 ak XP_008552645.1) EcK soti nan B. mori (Nimewo Aksè NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nimewo Aksè NP_651202), Apis mellifera (Nimewo Aksè XP_394838) ak Acyrthosiphon pisum (Nimewo Aksè XP_001947166); ak EPP ki soti nan B. mori (Nimewo Aksè XP_001947166) NP_001177919.1 ak NP_001243996.1) ak EO nan D. melanogaster (Nimewo Aksè NP_572986.1) (etap 1). Apre sa, filtre rezilta yo ki baze sou ekspresyon mRNA ki wo (>100 fragman/kilobaz ègzon pou chak milyon lekti trase (FPKM) oswa >85%) nan tisi repwodiktif (LRT fi oswa MAG) nan Gambia (etap 2). Pou amelyore espesifikite a, nou te chwazi anzim kandida ki eksprime tou nan tisi repwodiktif A. albimanus, yon espès anofèl ki pa sentetize oswa transfere ekdizòn pandan kwazman. Jèn kandida yo te filtre dapre ekspresyon ki ba (<100 FPKM oswa <85yèm persentil) nan tisi repwodiktif A. albimanus (etap 3). Kòm yon dènye filtè (etap 4), jèn kandida yo bezwen satisfè omwen youn nan bagay sa yo: (1) siyifikativman ogmante apre kwazman (P < 0.05) dapre analiz jèn ki eksprime diferansyèlman ak (2) nan tisi ki pa repwodiktif (< 85 % oswa <100 FPKM).
Nou te modifye metòd nou te dekri deja yo 28,29,30 pou nou te ka make tout òganis lan. An brèf, nou te teste Saccharomyces cerevisiae tip II (YSC2, Sigma) ki soti nan kalite sovaj la nan yon baz nitwojèn ledven (BD Difco, DF0335) ki genyen (pwa/vol) 2% glikoz (G7528, Sigma), 1.7% san asid amine ak silfat amonyòm (yon mwayen kilti) ak 5% silfat amonyòm 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) kòm sèl sous nitwojèn. Nou te rekipere ledven an pa santrifijasyon epi nou te bay lav moustik yo manje ad libitum jiskaske yo vin krizalid. Nou te ajoute farin pwason (0.5 mg pou chak 300 lav) pou anpeche mòtalite nan katriyèm etap la. Se sèlman fi yo te itilize nan eksperyans kwazman ak mal ki pa te make pou analize pwoteyòm mal ki te transfere pandan kwazman an.
Yo te fòse fi vyèj ki gen 4-6 jou epi ki gen etikèt 15N pou kwaze ak gason vyèj ki gen menm laj ak yo, san etikèt. Yo te verifye kwazman ki reyisi a lè yo te detekte bouchon kwazman anba mikwoskòp epifluoresans. A 3, 12, ak 24 hpm, yo te disseke atria 45-55 fi ki te kwaze yo nan 50 µl nan yon tanpon bikabonat amonyòm (pH 7.8) epi yo te omojeneize yo ak yon pilon. Yo te santrifije omojena a epi yo te melanje sipènatan an ak 50 µl nan 0.1% RapiGest (186001860, Waters) nan 50 mM bikabonat amonyòm. Yo te konjele sipènatan an ak grenn ki soti nan chak echantiyon sou glas sèk epi yo te voye yo lannwit lan nan laboratwa MacCoss nan Inivèsite Washington, kote yo te fini prepare echantiyon an pou LC-MS/MS. Yo te resispann grenn nan nan 50 µl nan 0.1% RapiGest nan 50 mM bikabonat amonyòm epi... sonike nan yon beny dlo. Konsantrasyon pwoteyin nan pelèt la ak sipènatant la te mezire pa tès BCA a, echantiyon yo te redwi ak 5 mM ditiyotritol (DTT; Sigma), alkile ak 15 mM iyodoasetamid (Sigma) epi enkube a 37 °C (1:0 50) pandan 1 èdtan ak tripsinizasyon: tripsin: rapò substrat). RapiGest te lize pa adisyon 200 mM HCl, ki te swiv pa enkubasyon a 37 °C pandan 45 minit ak santrifijasyon a 14,000 rpm pandan 10 minit a 4 °C pou retire debri. Echantiyon yo te lave pa ekstraksyon faz solid doub-mòd (katouch Oasis MCX, Waters) epi yo te resispann nan 0.1% asid formik pou yon konsantrasyon pwoteyin final de 0.33 µg µl-1. Pwoteyòm MAG ki pa make yo te analize menm jan an nan men gason vyèj yo. De replikasyon analitik te analize pou chak echantiyon. Apre sa, Yo te analize 1 µg nan chak lè l sèvi avèk yon kolòn silik fizyon 25-cm 75-μm avèk yon pyèj frit Kasil1 (PQ) silik fizyon 4-cm chaje ak résine faz envèse Jupiter C12 (Phenomenex) epi kromatografi likid 180 minit. Dijesyon echantiyon yo – MS/MS te fèt sou yon espektwomèt mas Q-Exactive HF (Thermo Fisher) avèk yon sistèm nanoACQUITY UPLC (Waters). Done akizisyon ki gen rapò ak done yo ki te pwodui pou chak analiz te konvèti an fòma mzML lè l sèvi avèk Proteowizard (vèsyon 3.0.20287) epi lè l sèvi avèk Comet31 (vèsyon 3.2) kont baz done FASTA ki gen sekans pwoteyin ki soti nan Anopheles gambiae (VectorBase vèsyon 54), Anopheles coluzzi. Yo te fè yon rechèch sou Mali-NIH (VectorBase vèsyon 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mas 2021), A. gambiae RNA-seq, ak tradiksyon twa-kad kontaminan imen li te ye yo. FDR ki koresponn ak kat peptid yo te detèmine lè l sèvi avèk Percolator32 (vèsyon 3.05) avèk yon papòt 0.01, epi peptid yo te rasanble nan idantifikasyon pwoteyin lè l sèvi avèk parsimoni pwoteyin nan Limelight33 (vèsyon 2.2.0). Pwoteyin relatif Yo te estime abondans lan lè l sèvi avèk faktè abondans espektral nòmalize (NSAF) ki kalkile pou chak pwoteyin nan chak seri jan yo te dekri deja. Yo te fè mwayèn NSAF relatif ak chak pwoteyin atravè echantiyon ki soti nan de replikasyon byolojik diferan. Maketaj 15N te maske pwoteyòm fi a avèk siksè, byenke yo te ka detekte yon ti kantite pwoteyin san mak nan vyèj ki make yo. Nou te anrejistre deteksyon rediksyon pwoteyin gason (1-5 spectre) nan echantiyon kri fi sèlman nan seri teknik, kote echantiyon kri yo te kouri apre echantiyon gason/akoupleman, kòm rezilta "transpòte" HPLC. Pwoteyin okazyonèl yo te jwenn kòm 'kontaminan' nan vyèj ki make yo nan Tablo Siplemantè 1.
De peptid antijenik, QTTDRVAPAPDQQQ (nan izotip PA) ak MESDGTTPSGDSEQ (nan izotip PA ak PB) nan Genscript. De peptid yo te konbine, answit konjige ak pwoteyin transpòtè KLH la epi enjekte nan lapen Nouvèl Zelann. Lapen yo te sakrifye apre katriyèm enjeksyon an, epi IgG total te izole pa pirifikasyon afinite. IgG ki soti nan lapen ki pi espesifik pou EPP a te itilize pou plis Western blotting.
Pou Western blots yo, yo te ajoute MAG (n = 10, kote n reprezante kantite echantiyon moustik byolojikman endepandan) ak LRT fi (n = 30) ki soti nan mal vyèj ki gen 4 jou ak fi vyèj oswa ki kwaze fòseman (<10 apre kwazman), yon tanpon ekstraksyon pwoteyin (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% dezoksikolat sodyòm; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktèl inibitè pwoteaz (Roche)) separeman. Echantiyon yo te omojeneize imedyatman apre diseksyon ak yon pèl (pèl an vè 2 mm, 2,400 rpm, 90 seg). Debri ensolub yo te retire pa santrifijasyon a 20,000 g a 4 °C. Pwoteyin yo te kantifye pa tès Bradford (Bio-Rad). Apre sa, yo te ajoute 20 µg pwoteyin MAG, 40 µg pwoteyin LRT, ak 20 µg pwoteyin rezidyèl an gwo. Yo te denatire epi separe pa 10% Bis-Tris NuPAGE lè l sèvi avèk yon tanpon MOPS. Pwoteyin yo te transfere nan manbràn polivinilidèn fliyò lè l sèvi avèk sistèm transfè iBlot2 (Thermo Fisher). Manbràn yo te lave de fwa nan 1× PBS-T (0.1% Tween-20 nan PBS) epi answit bloke nan tanpon blokaj Odyssey (Li-Cor) pandan 1 èdtan a 22°C. Manbràn yo te souke pandan tout lannwit lan a 4°C ak antikò prensipal poliklonal lapen anti-EPP koutim (1:700 nan tanpon blokaj) ak antikò prensipal monoklonal rat anti-aktin MAC237 (Abeam; 1:4,000). Manbràn yo te lave ak PBS-T epi answit enkube ak antikò segondè (bourik anti-lapen 800CW ak kabrit anti-rat 680LT (Li-Cor), tou de 1:20,000) nan tanpon blokaj ki gen 0.01% SDS ak 0.2% Tween -20 pandan 1 èdtan. inèdtan a 22 °C. Manbràn yo te lave ak PBS-T epi yo te pran imaj yo ak yon eskanè Odyssey CLx. Imaj yo te kolekte epi trete nan Image Studio (vèsyon 5.2). Yo pa t detekte yon bann espesifik ki koresponn ak izofòm EPP-RA a (82 kDa).
Yo te klone rejyon kodaj EPP yo (kòm izofòm AGAP002463-RB ki gen domèn fosfataz istidin, rechèch domèn konsève NCBI 34) ak EcK2 (AGAP002181) nan plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Yo bay lis amorseur yo nan Tablo Done Ekstansyon 2. Yo te mete uit lyezon GS4 (an tandem) anvan etikèt 6xHis C-tèminal konstriksyon pET-21a(+)-EcK2 la. Yo te pwodui pwoteyin rekombinan yo lè l sèvi avèk reyaksyon sentèz pwoteyin E. coli san selil NEBExpress (New England BioLabs). Yo te pirifye pwoteyin rekombinan yo lè l sèvi avèk kolòn spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). Yo te pwodui pwoteyin kontwòl diidrofolat reduktaz (DHFR) lè l sèvi avèk modèl ADN ki soti nan Twous Sentèz Pwoteyin E. coli san Selil NEBExpress la. Yo te estoke pwoteyin yo nan 50% gliserol nan PBS a -20 °C pou jiska 3 mwa.
Yo te mezire aktivite fosfataz EPP a ak ekstrè tisi yo lè l sèvi avèk 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Tanpon reyaksyon an te genyen 25 mM Tris, 50 mM asid asetik, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ak 1 mM DTT. Yo te omojeneize tisi a nan tanpon reyaksyon an epi yo te retire debri selilè yo pa santrifijasyon. Yo te kòmanse reyaksyon an lè yo te ajoute anzim oswa ekstrè tisi nan tanpon reyaksyon an ki genyen 2.5 mg ml-1 pNPP. Yo te enkube melanj reyaksyon an nan tanperati chanm nan fènwa, epi yo te mezire kantite pNP ki te konvèti soti nan pNPP a lè yo te mezire absòbans lan nan 405 nm nan divès moman.
Pou aktivite EcK in vitro, pwoteyin nan te enkube avèk 0.2 mg 20E oswa 3D20E nan 200 µl tanpon (pH 7.5) ki genyen 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ak 10 mM MgCl2 pandan 2 èdtan a 27 °C. Reyaksyon an te kanpe lè yo te ajoute 800 µl metanòl, answit li te refwadi a -20 °C pandan 1 èdtan, answit santrifije a 20,000 g pandan 10 minit a 4 °C. Apre sa, yo te analize sipènatant la pa HPLC-MS/MS. Pou inaktive pwoteyin yo te itilize nan gwoup kontwòl la ak chalè, pwoteyin yo te enkube nan 50% gliserin nan PBS pandan 20 minit a 95 °C.
Pou aktivite EPP in vitro, pwoteyin nan te enkube ak 3D20E22P (ekivalan a kantite yo te jwenn nan 18 pè MAG, pirifye pa HPLC-MS/MS) nan 100 µl tanpon (pH 7.5) ki gen 25 mM Tris, 50 mM asid asetik, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ak 1 mM DTT pandan 3 èdtan a 27 °C. Reyaksyon an te kanpe lè yo te ajoute 400 µl metanòl epi li te refwadi a -20 °C pandan 1 èdtan, answit santrifije a 20,000 g pandan 10 minit a 4 °C. Sipènatant la te analize pa HPLC-MS/MS.
Yo te anplifye fragman PCR pou EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ak EcK2 (556 bp) apati ADNc ki te prepare apati kadav moustik san tèt ki gen sèks melanje. Yo te anplifye fragman PCR kontwòl eGFP a (495 bp) apati pCR2.1-eGFP ki te dekri deja a; Yo bay lis amorseur PCR yo nan Tablo Done Elaji 2. Yo te mete fragman PCR a ant pwomotè T7 envèse yo sou plasmid pL4440 la. Yo te rekipere konstriksyon plasmid yo nan E. coli konpetan NEB 5-α (New England Biolabs) epi yo te verifye yo pa sekans ADN anvan yo te itilize yo (gade Done Siplemantè 1 pou sekans insert la). Yo te itilize amorseur ki koresponn ak pwomotè T7 la (Tablo Done Elaji 2) pou anplifye insert la nan plasmid ki baze sou pL4440 la. Yo te konfime gwosè pwodwi PCR la pa elektwoforèz sou jèl agaroz. Yo te transkri ARN doub bikonektif la soti nan modèl PCR yo lè l sèvi avèk Kit Transkripsyon Megascript T7 (Thermo Fisher) epi yo te pirifye l dapre enstriksyon manifakti a ak modifikasyon yo te dekri deja.
Pou enjeksyon dsRNA, yo te enjekte 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) nan yon konsantrasyon 10 ng nl-1 nan toraks gason oswa fi adilt (Nanoject III, Drummond) nan lespas 1 jou apre eklozyon an. Yo te detèmine nivo rediksyon jèn nan omwen twa replikasyon byolojik pa ekstraksyon ARN, sentèz ADNc, ak RT-qPCR. Pou enjeksyon ecdysone, yo te enjekte fi vyèj 4 jou oswa vyèj 6 jou ki te nouri ak san ak 0.13, 0.21, oswa 0.63 µg 20E oswa 3D20E (Nanoject III, Drummond) nan konsantrasyon 1.3, 2.1, respektivman, tou depann de konsepsyon eksperimantal la oswa 6.3 ng nl-1. Enjekte 100 nl etanòl 10% (vol/vol) nan dlo; 100 nl 3D20E22P nan 10% etanòl (ekivalan a 75% nan kantite yo jwenn nan yon pè MAG). Moustik yo te asiyen owaza nan gwoup enjeksyon an.
Pou tès ponn yo, yo te bay fi ki gen 3 jou manje san moun ad libitum. Retire moustik ki te manje pasyèlman oswa ki pa t manje. Tou depan de tretman an, yo te mete fi yo nan gode ponn separe pandan kat nwit omwen 48 èdtan apre repa san an. Yo te konte ze yo anba yon estereyoskop (Stemi 508, Zeiss); pou fi ki te kwaze, ze ki te kale pou tounen lav yo te konsidere kòm fètil.
Pou esè kwazman yo, yo te kite fi yo pou omwen 2 jou selon tretman an pou yo te devlope rezistans nan kwazman, epi yo te mete mal ki gen menm laj ak tip sovaj yo nan menm kaj la apre sa. De nwit apre, yo te disseke vezikil fi ki te fètilize yo epi yo te libere ADN jenomik la pa konjelasyon-dekonjelasyon ak sonikasyon nan yon tanpon ki gen 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, ak 25 mM NaCl (pH 8.2). Yo te enkube echantiyon yo ak Proteinaz K (0.86 µg µl-1) pandan 15 minit a 55 °C, epi apre sa 10 minit a 95 °C. Yo te delye preparasyon ADN jenomik brit yo 10 fwa epi yo te sibi deteksyon qPCR pou sekans kwomozòm Y yo; amorseur yo nan Tablo Done Elaji 2. Absans sekans kwomozòm Y endike pa gen okenn kwazman.
Pou tès re-kwazman yo, yo te egzamine fi ki te kwaze pa fòs pou wè si te gen bouchon kwazman pou konfime si yo anfòm epi yo te kite yo pandan 2 jou pou yo devlope rezistans a kwazman san mal, jan sa te dekri deja 36. Apre sa, yo te mete mal ki te gen espèm transjenik DsRed yo nan kaj fi yo. De nwit apre, yo te disseke vezikil fekondasyon yo nan fi yo, epi yo te prepare ADN jenomik jan sa dekri pi wo a epi yo te soumèt yo a deteksyon qPCR pou transjèn DsRed la; amorseur yo nan Tablo Done Elaji 2. Absans transjèn DsRed la te endike ke pa t gen okenn re-kwazman ki te fèt.
Yo te sentetize 3D20E jan yo te dekri deja 37. An brèf, yo te fonn 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) nan 10 ml dlo, epi yo te ajoute 30 mg nwa platinum (an poud, Sigma-Aldrich). Yo te fè yon ti kouran O2 kontinye ap fè bul nan melanj reyaksyon an, epi yo te brase l nan tanperati chanm. Apre 6 èdtan, yo te ajoute 30 mL metanòl pou yo te ka sispann reyaksyon an. Yo te santrifije melanj lan pou retire patikil katalis yo. Yo te evapore sipènatant lan jiskaske li sèk anba vid nan tanperati chanm. Yo te fonn pwodui reyaksyon sèk la nan 10% etanòl ak metanòl pou enjeksyon pou analiz HPLC-MS/MS. To konvèsyon an (soti nan 20E pou rive nan 3D20E) te apeprè 97% (Fig. 4b), epi spectre MS 3D20E sentetize a te koresponn ak sa yo te jwenn nan fi ki te kwaze yo (Fig. 4c).
Lejand lan gen detay espesifik sou tès estatistik yo te fè yo. Yo te itilize GraphPad (vèsyon 9.0) pou fè tès egzak Fisher a, tès Mantel-Cox la, ak tès t Student la. Yo te fè tès Cochran-Mantel-Haenszel yo lè l sèvi avèk yon script R koutim (disponib nan https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Yo te teste distribisyon done yo pou nòmalite lè l sèvi avèk tès Shapiro-Wilk la ak yon papòt siyifikasyon 0.05. Lè done yo te echwe tès nòmalite a, yo te fè tès Mann-Whitney la. Yo te analize done siviv yo lè l sèvi avèk tès Mantel-Cox la. Yo te itilize pake DESeq2 la (vèsyon 1.28.1) pou fè analiz ekspresyon diferansyèl nan nivo jèn RNA-seq. Ba orizontal la sou graf la reprezante medyàn lan. Yo te itilize yon valè siyifikasyon P = 0.05 kòm papòt pou tout tès yo.
Pou plis enfòmasyon sou konsepsyon etid la, gade rezime Rapò Rechèch sou Lanati ki lye ak atik sa a.
Done pwoteyomik MS yo te depoze nan ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) atravè PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) avèk idantifikatè seri done PXD032157 la.
Yo depoze seri done RNA-seq la nan Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) anba nimewo seri GSE198665 la.
Ou ka jwenn lòt ansanm done ki pwodui ak/oswa analize pandan etid aktyèl la nan men otè korespondan yo sou yon demann rezonab. Atik sa a bay done sous yo.
De Loof, A. Ecdysteroids: Estewoyid sèks ensèk neglije? Gason: Black Box. Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-idwoksiekdizon ak devlopman ovè nan Anopheles stephens.J. Fizyoloji Ensèk.28, 97–109 (1982).