Triyaj pwoteyin nan chemen sekresyon an esansyèl pou mentni konpatimantasyon selilè ak omeyostazi. Anplis triyaj ki medyatè pa kokiy la, wòl lipid yo nan triyaj kinesin nan pwosesis transpò sekresyon an se yon kesyon fondamantal ki la depi lontan ki poko jwenn repons. La a, nou fè imaj 3D similtane miltikoulè an tan reyèl ak gwo rezolisyon pou pwouve in vivo ke pwoteyin imobilize ak glikosilfosfatidilinozitol ki fèk sentetize ak pati lipid seramid ki trè long yo gwoupe epi klase nan sit sòti andoplasm espesyalize, ki diferan de sa pwoteyin transmembranè yo itilize. Anplis de sa, nou montre ke longè chèn seramid nan manbràn retikilòm andoplasmik la enpòtan pou selektivite triyaj sa a. Etid nou an bay premye prèv dirèk in vivo pou klase kago pwoteyin ki baze sou longè chèn lipid nan sit ekspòtasyon selektif nan chemen sekresyon an.
Nan selil ekaryotik yo, pwoteyin ki sentetize nan retikulum andoplasmik (RE) a klase pandan transpò a atravè chemen sekresyon an pou yo rive nan destinasyon selilè ki apwopriye a (1). Anplis klasman medyatè pa kouch la, yo te espekile depi lontan ke sèten lipid kapab sèvi tou kòm pwen sòti selektif lè yo gwoupe yo nan domèn manbràn espesifik ke pwoteyin espesifik sa yo (2-5). Sepandan, toujou gen yon mank prèv dirèk in vivo pou pwouve posib mekanis sa a ki baze sou lipid. Pou nou te kapab rezoud pwoblèm debaz sa a, nou te etidye nan ledven kijan pwoteyin ki ankre nan glikosilfosfatidilinozitol (GPI) (GPI-AP) yo ekspòte yon fason diferan soti nan RE a. GPI-AP yo se yon varyete pwoteyin sifas selilè ki konekte ak lipid (6, 7). GPI-AP se yon pwoteyin sekrete ki tache ak feyè ekstèn manbràn plasma a atravè pati glikolipid la (ank GPI). Yo aksepte ank GPI kòm modifikasyon konsèvatif apre tradiksyon nan lumen RE a (8). Apre atachman, GPI-AP pase nan aparèy Golgi a (5, 9) soti nan RE a rive nan manbràn plasma a. Prezans lank GPI yo lakòz GPI-AP transpòte separeman de pwoteyin sekrete transmembranè yo (ki gen ladan lòt pwoteyin manbràn plasma) sou chemen sekresyon an (5, 9, 10). Nan selil ledven, GPI-AP yo separe de lòt pwoteyin sekrete nan retikilòm andoplasmik la, epi answit pake nan vesikil inik ki vlope pa konplèks pwoteyin kouch II (COPII) (6, 7). Detèminan pwosesis klasifikasyon sa a nan pwosesis ekspòtasyon RE a pa klè, men yo espekile ke mekanis sa a ka mande lipid, espesyalman remodelasyon estriktirèl pòsyon lipid lank GPI a (5, 8). Nan ledven, remodelasyon lipid GPI a kòmanse imedyatman apre GPI a tache, epi nan anpil ka, li lakòz seramid mare ak asid gra satire chèn long 26-kabòn (C26:0) (11, 12). Seramid C26 la se prensipal seramid ki pwodui pa selil ledven jiskaprezan. Li sentetize nan RE a epi pi fò ladan l ekspòte nan aparèy Golgi a atravè vesikil COPII (13). Ekspòtasyon GPI-AP nan RE a mande espesyalman yon sentèz seramid kontinyèl (14, 15), e kidonk, konvèsyon seramid an seramid inositol fosfat (IPC) nan aparèy Golgi a depann de sentèz lank GPI (16). Etid byofizik ak manbràn atifisyèl yo montre ke seramid ki gen chèn asil ki trè long ka koalize pou fòme domèn ki byen òdone ak pwopriyete fizik inik (17, 18). Done sa yo mennen nan ipotèz ke seramid C26 la ak GPI-AP ak seramid C26 la itilize pwopriyete fizik yo pou koalize nan rejyon ki byen òdone oswa rejyon nan anviwònman lipid manbràn RE ki relativman dezòdone a. Li konpoze sitou de gliserolipid kout ak ensature (C16:1 ak C18:1) (19, 20). Rejyon sa yo pral konsantre selektivman sou sit sòti RE espesifik (ERES), kote seramid ak GPI-AP ki baze sou seramid ka ko-transpòte nan Golgi a nan menm vesikil COPII dedye a (5).
Nan etid sa a, nou teste mekanis ki baze sou lipid sa a dirèkteman lè nou itilize mikwoskòp imaj konfokal an tan reyèl super-rezolisyon (SCLIM), ki se yon teknik mikwoskòp dènye kri ki ka obsève pwoteyin ki make ak fliyoresan an menm tan. Imaj twa koulè ak twa dimansyon (3D) yo gen yon rezolisyon ak yon vitès trè wo nan selil vivan yo (21, 22).
Nou te premye aplike teknoloji SCLIM pou defini pi byen kijan GPI-AP nòmal ak gwoup seramid C26 te tès depistaj nan pwoteyin transmembranè sekrete apre yo fin kite RE nan S. cerevisiae. Pou nou te ka verifye klasifikasyon RE a, nou te itilize yon sistèm jenetik ki ka dirèkteman vizyalize nouvo kago sentetize k ap antre nan ERES in vivo (7, 23). Kòm kago, nou te chwazi GPI-AP Gas1 ki baze sou seramid C26 ki make ak pwoteyin fliyoresan vèt (GFP) ak pwoteyin fliyoresan transmembranè Mid2 ki make ak pwoteyin fliyoresan tou pre enfrawouj (iRFP), tou de vize manbràn plasma a (24-26). Nan mutan sec31-1 ki sansib a tanperati a, de kago sa yo eksprime anba yon pwomotè galaktoz-endiktib ak yon makè ERES konstititif. Nan tanperati ekstrèm (37°C), paske mitasyon sec31-1 la afekte fonksyon konpozan kouch COPII Sec31 pou anpeche jèminasyon COPII ak ekspòtasyon RE, nouvo kago sentetize a akimile nan RE a (23). Apre yo te fin refwadi nan yon tanperati ki ba (24°C), selil mutant sec31-1 yo te refè nan zòn sekresyon an, epi nouvo kago sentetik ki te akimile a te kòmanse ekspòte soti nan RE a. Vizyalizasyon CLIM te montre ke pifò nan Gas1-GFP ak Mid2-iRFP ki fèk sentetize yo te toujou akimile nan RE selil mutant sec31-1 yo apre enkubasyon nan 37°C epi answit lage nan 24°C pandan 5 minit (Figi 1). Piske Mid2-iRFP distribye sou tout manbràn RE a, epi Gas1-GFP konsantre epi rasanble nan zòn manbràn RE diskontinu a, distribisyon yo konplètman diferan (Figi 1, A rive C ak Fim S1). Anplis de sa, jan yo montre nan Figi 1D, gwoup Gas1-GFP a pa gen Mid2-iRFP. Rezilta sa yo endike ke pwoteyin GPI-AP ak transmembran yo te separe nan diferan rejyon manbràn RE byen bonè. Gwoupman Gas1-GFP a adjasan a yon ERES espesifik ki make ak pwoteyin kouch COPII mCherry a Sec13 (Figi 1, E ak F, ak fim S1) (23).
Selil sec31-1 yo eksprime sekresyon pwovoke pa galaktoz, yon seramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, vèt) ki gen yon chèn asil long (C26) ak pwoteyin transmembranè Mid2-iRFP (TMP, ble) epi yo te enkube etikèt ERES konstriktif Sec13-mCherry (ERES, magenta) sa a nan 37°C pandan 30 minit, yo te deplase l a 24°C, epi yo te pran imaj li pa SCLIM 5 minit apre. (A rive C) montre yon imaj 2D reprezantatif fizyone oswa yon sèl imaj yon plan (A), yon imaj pwojeksyon 2D 10 seksyon-z (B) oswa yon imaj emisfè selilè 3D kago ak makè ERES (C). Ba echèl 1μm (A ak B). Inite echèl la se 0.551μm (C). Yo te detekte Gas1-GFP nan rejyon oswa gwoupman ER disrè, pandan y ap detekte Mid2-iRFP epi li te distribye li nan tout manbràn ER a (C). (D) Grafik la montre entansite fliyoresans relatif Gas1-GFP ak Mid2-iRFP nan gwoup Gas1-GFP a sou liy flèch blan an (agoch). AU, inite abitrè. (E ak F) reprezante imaj 3D ki konbine mak machandiz yo ak mak ERES la. Gwoup Gas1-GFP yo te detekte toupre ERES espesifik la. Inite echèl la se 0.551μm. (F) Flèch blan solid la make gwoup Gas1-GFP ki asosye avèk ERES la. Panno mitan ak dwat yo montre imaj 3D elaji ki fizyone a ak yon vi wotasyon gwoup Gas1-GFP ki chwazi a.
Relasyon espasyal sere ant gwoup Gas1-GFP a ak yon ERES espesifik endike ke Gas1-GFP ka antre nan ERES selektif, ki diferan de selektivite Mid2-iRFP itilize pou kite ER a. Pou adrese posibilite sa a, nou te mezire rapò ERES la pou sèlman youn oubyen de machandiz (Figi 2, A rive C). Nou te jwenn ke pifò ERES (70%) genyen yon sèl kalite kago. Imaj anba Figi 2C a montre de egzanp tipik ERES ki gen sèlman Gas1-GFP (Figi 1) oubyen sèlman Mid2-iRFP (Figi 2). Okontrè, apeprè 20% nan ERES yo genyen de kago ki sipèpoze nan menm zòn nan. Nou te jwenn ke kèk ERES (10%) genyen de kalite kago, men yo te izole nan zòn byen diferan. Se poutèt sa, analiz estatistik sa a montre ke apre yo fin ekspòte ER a, GPI-AP Gas1-GFP ak kago transmembranè Mid2-iRFP a divize an diferan ERES (Figi 2D). Efikasite klasman sa a trè konsistan avèk analiz byochimik anvan an (6) ak detèminasyon mòfolojik (7). Nou kapab obsève tou konpòtman kago an karantèn ki antre nan ERES la (Figi 2E ak Fim S2). Figi 2E montre ke se sèlman yon ti pòsyon nan Gas1-GFP (panèl 3) oswa Mid2-iRFP (panèl 4) ki antre nan ERES la soti nan yon bò epi li limite nan yon zòn separe. Panèl 5 nan Figi 2E montre ke Gas1-GFP ak Mid2-iRFP pafwa yo jwenn nan menm ERES la, men yo antre soti nan diferan bò epi yo konsantre nan rejyon separe ki ka reprezante diferan vesikil COPII. Nou te konfime tou ke separasyon ak klasifikasyon GPI-AP Gas1 ki baze sou seramid C26 kòm ERES selektif la espesifik paske yon lòt kago sekresyon transmembran, pwoteyin manbràn plasma ki make ak GFP Axl2 (27), ki montre yon konpòtman menm jan ak Mid2-iRFP. (Foto S1 ak Fim S3). Nouvo Axl2-GFP sentetize a distribye atravè manbràn RE a tankou Mid2-iRFP (Figi S1, A ak B), epi li ko-lokalize avèk Mid2-iRFP nan pifò ERES (Figi S1, B rive D). Panno 1 ak 2 nan Figi 1. S1C montre de egzanp tipik ERES kote de kago transmembran sipèpoze. Nan ka sa yo, tou de machandiz yo antre nan ERES ansanm (Figi S1E, Panno 3 ak Fim S3).
Selil sec31-1 yo ki eksprime sekresyon galaktoz endiktif, Gas1-GFP (GPI-AP, vèt) ak Mid2-iRFP (TMP, ble) ak make ERES konstititif Sec13-mCherry (ERES, magenta) yo te mete a 37°C. Apre enkubasyon pandan 30 minit nan °C, deplase a 24°C pou libere blòk sekresyon an, epi pran imaj la ak SCLIM apre 20 minit. (A a C) Imaj pwojeksyon 2D reprezantatif (A; ba echèl, 1μm) oswa imaj emisfè selilè 3D (B ak C; inite echèl, 0.456μm) nan kago a ak 10 seksyon z ki make ak ERES. Panèl ki pi ba a nan (B) ak panèl la nan (C) montre imaj trete pou montre sèlman machandiz ki prezan nan ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) ak Mid2-iRFP (ble klè)]. (C) Flèch ouvè: ERES sèlman pote yon sèl moso kago (1 a 4). Flèch gri: ERES gen kago separe (5). Flèch blan solid: ERES gen kago ki ko-lokalize. Anba: ERES endividyèl ki chwazi a gen sèlman Gas1-GFP (1) oswa Mid2-iRFP (2). Ba echèl, 100 nm. (D) Kantifikasyon mikwofotografi ki dekri nan (C). Pousantaj mwayèn ERES ki gen yon sèl kago (Gas1-GFP oswa Mid2-iRFP), kago separe ak kago ki sipèpoze. Nan twa eksperyans endepandan, n=432 nan 54 selil. Ba erè = SD. Tès t bilateral san pè. *** P = 0.0002. (E) Imaj 3D ERES chwazi nan kago an karantèn ki make ak (C). Gas1-GFP (vèt) (3) oswa Mid2-iRFP (ble) (4) antre nan ERES (magenta) sou yon bò epi li limite a yon ti zòn nan ERES. Pafwa, tou de kalite kago yo antre nan menm ERES la (5) sou menm bò a epi yo limite a yon zòn izole andedan ERES la. Ba echèl, 100 nm.
Apre sa, nou te teste yon ipotèz ki di seramid ki gen yon chèn asil long (C26) ki prezan nan manbràn RE a kondwi gwoupman espesifik ak klasman Gas1 nan ERES selektif. Pou sa, nou te itilize yon souch ledven modifye GhLag1, kote de sentaz seramid andojèn Lag1 ak Lac1 yo te ranplase pa GhLag1 (omolog Lag1 koton an), sa ki te bay yon souch ledven ak yon souch seramid nan manbràn selilè ki pi kout pase kalite sovaj la (Figi 3A) (28). Analiz espektwometri mas (MS) te montre ke nan souch kalite sovaj yo, 95% nan seramid total la se seramid ki gen yon chèn trè long (C26), alòske nan GhLag1, 85% nan seramid la gen yon chèn trè long (C18 ak C16). ), sèlman 2% nan seramid la se seramid ki gen yon chèn trè long (C26). Malgre ke seramid C18 ak C16 yo se prensipal seramid yo detekte nan manbràn GhLag1 la jiskaprezan, analiz MS te konfime tou ke lank GPI Gas1-GFP ki eksprime nan souch GhLag1 la gen seramid C26, ki konparab ak lipid tip sovaj yo. Kalite a se menm (Fig. 3A) (26). Kidonk, sa vle di ke anzim remodelasyon seramid Cwh43 la trè selektif pou seramid C26, jan yo montre nan Figi 26, li enkòpore preferansyèlman lank GPI ki soti nan yon ti kantite seramid C26 nan souch GhLag1 la. S2 (29). Malgre sa, manbràn selilè GhLag1 la fondamantalman sèlman gen seramid C18-C16, alòske Gas1-GFP toujou gen seramid C26. Reyalite sa a fè souch sa a yon zouti ideyal pou rezoud espesyalman pwoblèm longè chèn asil seramid manbràn nan RE a. Wòl ipotetik klas ak klasman an. Apre sa, nou te premye etidye kapasite C26 Gas1-GFP pou akimile an gwoup nan GhLag1 ak yon alèl mutant sansib a tanperati nan sec31-1 atravè mikwoskopi fluoresans konvansyonèl, kote se sèlman chèn long (C18-C16) ki egziste nan manbràn ER Seramid la (Fig. 3). Nou te obsève ke nan sec31-1, pifò Gas1-GFP te konsantre an gwoup, alòske Gas1-GFP nan sec31-1 GhLag1 ak manbràn ER seramid long (C18-C16) pa te sitou gwoupe epi distribye nan tout manbràn ER a. Pou nou pi presi, paske gwoupman ki baze sou seramid C26 la gen yon relasyon sere avèk ERES espesifik (Figi 1), nou te envestige apre sa si pwosesis sa a ka enplike tou fonksyon mekanis pwoteyin ekspòtasyon ER a. GPI-AP itilize yon sistèm COPII espesyal pou ekspòtasyon ER, ki reglemante aktivman pa remodelasyon estriktirèl Ted1 nan pòsyon glikan lank GPI a (30, 31). GPI-glikan rekombinan an rekonèt pa konplèks reseptè kago transmembran p24 la, ki an vire rekrite Lst1 selektivman, ki se yon izofòm espesifik nan prensipal sou-inite lyezon kago COPII Sec24 la, pou fòme yon vesikil COPII rich an GPI-AP (31-33). Se poutèt sa, nou te konstwi yon doub mutan ki te konbine sipresyon pwoteyin endividyèl sa yo (konpozan konplèks p24 Emp24 la, anzim remodèl GPI-glikan Ted1 ak sou-inite COPII espesifik Lst1 la) ak souch mutan sec31-1 la, epi nou te etidye yo. Èske li posib pou fòme Gas1-cluster GFP (Figi 3). Nou te obsève ke nan sec31-1emp24Δ ak sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP a sitou pa gwoupe epi li distribye nan tout manbràn ER a, jan nou te wè deja nan sec31-1 GhLag1, alòske nan sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP a tankou sec31-1. Rezilta sa yo endike ke anplis prezans seramid C26 nan manbràn ER a, gwoupman Gas1-GFP a bezwen mare tou ak konplèks p24 la, epi li pa mande rekritman Lst1 espesifik. Apre sa, nou te eksplore posiblite ke longè chèn seramid nan manbràn ER a ka kontwole lyezon Gas1-GFP ak p24. Sepandan, nou te jwenn ke prezans seramid C18-C16 nan manbràn nan pa afekte GPI-glikan yo rekonstwi pa konplèks p24 la (Figi S3 ak S4, A ak B) oswa lyezon ak GPI-AP epi ekspòtasyon GPI-AP. Rekrite soutip COPII Lst1 (Figi S4C). Se poutèt sa, gwoupman depandan seramid C26 la pa mande entèraksyon pwoteyin ak diferan mekanis pwoteyin ekspòtasyon ER, men li sipòte yon mekanis klasman altènatif ki kondwi pa longè lipid. Apre sa, nou te analize si longè chèn asil seramid nan manbràn ER a enpòtan pou klasifikasyon efikas Gas1-GFP kòm ERES selektif. Piske Gas1 nan souch GhLag1 ki gen seramid chèn kout la kite RE a epi li antre nan manbràn plasma a (Figi S5), nou kwè ke si longè chèn asil seramid la kondwi klasman an, Gas1 ki nan souch GhLag1 la ka redireksyone epi kwaze. Pwodui ERES ki gen menm manbràn nan.
(A) Manbràn selilè GhLag1 la gen ladan l sitou seramid C18-C16 ki pi kout, alòske lank GPI Gas1-GFP a toujou gen menm IPC C26 la ak selil tip sovaj yo. Anwo: analiz longè chèn asil seramid nan manbràn selilè souch tip sovaj (Wt) ak GhLag1p pa espektwometri mas (MS). Done yo reprezante pousantaj seramid total la. Mwayèn twa eksperyans endepandan. Ba erè = SD. Tès t bilateral san pè. **** P <0.0001. Panèl anba: analiz MS sou longè chèn asil IPC ki prezan nan lank GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) ki eksprime nan souch tip sovaj la ak GhLag1p yo. Done yo reprezante pousantaj siyal IPC total la. Mwayèn senk eksperyans endepandan. Ba erè = SD. Tès t bilateral san pè. ns, pa enpòtan. P = 0.9134. (B) Mikwograf fliyoresans selil sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ak sec31-1lst1Δ ki eksprime Gas1-GFP pwovoke pa galaktoz yo te enkube a 37°C pandan 30 minit epi yo te pase desann nan Fè mikwoskopi fliyoresans woutin apre 24°C. Flèch blan: Gwoupman Gas1-GFP ER. Flèch ouvè: Gas1-GFP ki pa gwoupe distribye sou tout manbràn ER a, ki montre koloran bag nikleyè karakteristik ER a. Ba echèl, 5μm. (C) Kantifikasyon fotomikwograf ki dekri nan (B). Pousantaj mwayèn selil ki gen estrikti Gas1-GFP ponktue. Nan twa eksperyans endepandan, n≥300 selil. Ba erè = SD. Tès t bilateral san pè. **** P <0.0001.
Pou rezoud pwoblèm sa a dirèkteman, nou te fè vizyalizasyon SCLIM Gas1-GFP ak Mid2-iRFP nan GhLag1 avèk alèl mutant sec31-1 ki sansib a tanperati a (Figi 4 ak Fim S4). Apre ER a te rete nan 37°C epi apre sa li te libere nan 24°C, pifò nan Gas1-GFP ki fèk sentetize a pa t gwoupe epi distribye nan tout manbràn ER a, jan mikwoskòp konvansyonèl yo te obsève (Figi 4, A ak B). Anplis de sa, yon gwo pousantaj ERES (67%) gen ladan de kalite kago ki ko-lokalize ladan l (Figi 4D). Panno 1 ak 2 nan Figi 4C montre de egzanp tipik ERES ak Gas1-GFP ak Mid2-GFP ki sipèpoze. Anplis de sa, tou de machandiz yo te rekrite nan menm ERES la (Figi 4E, panno 3 ak fim S4). Se poutèt sa, rezilta nou yo endike ke longè chèn asil seramid nan manbràn ER a se yon detèminan enpòtan nan agregasyon ak klasifikasyon pwoteyin ER.
Selil Sec31-1 GhLag1 ki eksprime sekresyon pwovoke pa galaktoz, Gas1-GFP (GPI-AP, vèt) ak Mid2-iRFP (TMP, ble) ak Sec13-mCherry make ak ERES konstititif (ERES, magenta). Enkube a 37°C. Kontinye pandan 30 minit, desann a 24°C pou libere sekresyon yo, epi pran imaj ak SCLIM apre 20 minit. (A rive C) Imaj pwojeksyon 2D reprezantatif (A; ba echèl, 1μm) oswa imaj emisfè selil 3D (B ak C; inite echèl, 0.45μm) nan 10 seksyon z yo ki make pa kago ak ERES. Panèl ki pi ba a nan (B) ak panèl la nan (C) montre imaj trete pou montre sèlman machandiz ki prezan nan ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) ak Mid2-iRFP (ble klè)]. (C) Flèch blan plen: ERES, machandiz yo sipèpoze. Flèch ouvè: ERES la gen yon sèl atik. Panèl anba a: ERES ki chwazi a gen machandiz ki sipèpoze (1 ak 2) ki make nan (C). Ba echèl, 100 nm. (D) Kantifikasyon mikwofotografi ki dekri nan (C). Nan inite sec31-1 ak sec31-1 GhLag1 yo, se yon sèl kago (Gas1-GFP oswa Mid2-iRFP) ki enkli, ak pousantaj mwayèn ERES pou kago izole ak kago ki sipèpoze. Nan twa eksperyans endepandan, n = 432 nan 54 selil (sec31-1) ak n = 430 nan 47 selil (sec31-1 GhLag1). Ba erè = SD. Tès t bilateral san pè. *** P = 0.0002 (sec31-1) ak ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imaj 3D ERES ki chwazi a ak kago ki sipèpoze (3) ki make nan (C). Gas1-GFP (vèt) ak Mid2-iRFP (ble) apwoche ERES (magenta) sou menm bò a epi yo rete nan menm zòn restriksyon ERES la. Ba echèl, 100 nm.
Etid sa a bay prèv dirèk in vivo ki montre ke kago pwoteyin ki baze sou lipid yo klase nan sit ekspòtasyon selektif nan chemen sekresyon an, epi li revele enpòtans longè chèn asil pou selektivite klasifikasyon. Lè nou itilize yon teknik mikwoskopi pwisan ak dènye kri ki rele SCLIM, nou te demontre nouvo Gas1-GFP sentetize a (yon GPI-AP enpòtan nan manbràn plasma a ak yon pòsyon lipid seramid chèn asil (C26) ki trè long) nan ledven). Rejyon yo gwoupe nan ER disrè yo asosye avèk ERES espesifik, alòske pwoteyin sekrete transmembranè yo distribye nan tout manbràn ER a (Figi 1). Anplis de sa, de kalite machandiz sa yo antre nan diferan ERES selektivman (Figi 2). Longè chèn asil seramid selilè a nan manbràn lan redwi soti nan C26 pou rive nan C18-C16, gwoupman Gas1-GFP a deranje nan rejyon ER disrè a, epi Gas1-GFP redireksyone pou kite ER a ak pwoteyin transmembranè a atravè menm ERES la (Figi 3 ak Figi 3).4).
Malgre ke GPI-AP itilize yon mekanis pwoteyin espesyalize pou sòti nan RE a, nou te jwenn ke separasyon seramid C26 ki depann de lipid la pa depann de entèraksyon pwoteyin diferan ki ka mennen nan espesyalizasyon ERES la (Figi S4 ak S5). Okontrè, rezilta nou yo sipòte yon mekanis klasifikasyon altènatif ki kondwi pa gwoupman pwoteyin ki baze sou lipid ak esklizyon lòt kago ki vin apre. Obsèvasyon nou yo endike ke rejyon Gas1-GFP a oswa gwoupman ki asosye avèk yon ERES espesifik manke pwoteyin sekrete transmembran Mid2-iRFP a, ki endike ke gwoupman GPI-AP ki depann de seramid C26 la pral fasilite antre yo nan ERES ki enpòtan an, epi an menm tan, eskli sekresyon transmembran yo antre nan ERES patikilye sa a (Figi 1 ak 2). Okontrè, prezans seramid C18-C16 nan manbràn RE a pa lakòz GPI-AP fòme rejyon oswa gwoupman, kidonk yo pa eskli oswa ranplase pwoteyin sekrete transmembran nan menm ERES la (Figi 3 ak 4). Se poutèt sa, nou pwopoze ke seramid C26 la kondwi separasyon ak klasifikasyon lè li fasilite gwoupman pwoteyin ki lye ak ERES espesifik.
Kijan pou reyalize gwoupman seramid C26 sa a ki depann de lipid nan yon zòn espesifik nan RE a? Tandans seramid manbràn lan pou separe lateralman ka lakòz seramid GPI-AP ak C26 fòme ti lipid ki byen òdone nan anviwònman lipid ki pi iregilye nan manbràn RE a ki gen gliserolipid ki pi kout ak ensature. Gwoupman kalite siperyè (17, 18). Ti gwoupman tanporè sa yo ka plis fizyone nan gwoupman ki pi gwo ak pi estab apre yo fin lye ak konplèks p24 la (34). An akò avèk sa, nou te montre ke C26 Gas1-GFP bezwen kominike avèk konplèks p24 la pou fòme pi gwo gwoupman vizib (Figi 3). Konplèks p24 la se yon oligomè etewozigòt ki konpoze de kat pwoteyin transmembran p24 diferan nan ledven (35), ki bay yon lyezon miltivalan, ki ka mennen nan lyezon kwaze nan ti gwoupman GPI-AP yo, kidonk jenere yon pi gwo gwoupman ki estab (34). Entèraksyon ant ektodomèn pwoteyin GPI-AP yo kapab kontribye tou nan agregasyon yo, jan yo montre pandan transpò Golgi yo nan selil epitelyal polarize mamifè yo (36). Sepandan, lè seramid C18-C16 la prezan nan manbràn ER a, lè konplèks p24 la mare ak Gas1-GFP, gwo gwoup separe p ap fòme. Mekanis ki kache a ka depann de pwopriyete fizik ak chimik espesifik seramid ki gen chèn asil long lan. Etid byofizik sou manbràn atifisyèl yo montre ke byenke seramid ki gen chèn asil long (C24) ak kout (C18-C16) yo ka lakòz separasyon faz, se sèlman seramid ki gen chèn asil long (C24) ki ka ankouraje yon gwo koubisyon ak koube fim pou chanje fòm fim nan. Atravè referans mityèl (17, 37, 38). Li te demontre ke eliks transmembranè TMED2 a, omolog imen Emp24 la, reyaji selektivman avèk sfingomyelin ki baze sou seramid C18 nan lobil sitoplasmik yo (39). Lè nou te itilize simulation dinamik molekilè (MD), nou te jwenn ke seramid C18 ak C26 yo akimile otou lobil sitoplasmik eliks transmembranè Emp24 la, epi yo gen preferans menm jan an (Figi S6). Li enpòtan pou note ke sa endike ke eliks transmembranè Emp24 la ka mennen nan yon distribisyon asimetrik lipid nan manbràn lan. Sa a se yon rezilta resan ki baze sou selil mamifè. Similasyon MD menm jan an montre tou prezans lipid etè (40). Se poutèt sa, nou espekile ke seramid C26 nan de lobil ER26 yo rich lokalman. Lè GPI-AP nan lobil luminal yo lye dirèkteman ak p24 miltivalan epi akimilasyon seramid C26 otou p24 nan lobil sitoplasmik yo, li ka ankouraje agregasyon pwoteyin ki akonpaye a ak koube manbràn ki pwodui atravè dwèt yo (41), sa ki lakòz GPI-AP separe an rejyon disrè adjasan a ERES, ki favorize tou rejyon ki trè koube nan manbràn ER a (42). Rapò anvan yo te sipòte mekanis pwopoze a (43, 44). Lyezon miltivalan oligolektin, patojèn oswa antikò ak glikosfingolipid ki baze sou seramid (GSL) sou manbràn plasma a deklanche yon gwo agregasyon GSL, amelyore separasyon faz epi lakòz defòmasyon ak internalizasyon manbràn (44). Iwabuchi elatriye (43) Yo te jwenn ke an prezans chenn asil long (C24) men pa kout (C16), ligand miltivalan ki lye ak laktosilceramid GSL la te pwovoke fòmasyon gwo gwoupman ak envajinasyon manbràn, epi transdiksyon siyal sitoplasm Lyn ki medyatè sou feyè yo antremele pa chenn asil nan netrofil makonnen.
Nan selil epitelyal polarize mamifè yo, konsantrasyon rezo anti-Golgi (TGN) nan nivo manbràn plasma apikal la kontwole separasyon ak klasman GPI-AP (10, 45). Agregasyon sa a kondwi pa oligomerizasyon GPI-AP (36), men li ka depann tou de longè chèn seramid nou jwenn nan ledven. Malgre ke GPI-AP mamifè a gen yon lank ki baze sou lipid etè, epi estrikti chimik li trè diferan de seramid ki gen chèn asil trè long lan, yon etid resan te jwenn ke tou de lipid yo gen pwopriyete fizik ak chimik ak fonksyon ki sanble evolisyonèman (40). Se poutèt sa, pati lipid etè nan selil mamifè yo ka sanble ak seramid C26 nan ledven, epi wòl li se asosye ak seramid ki gen chèn long nan manbràn nan pou ankouraje agregasyon ak klasman GPI-AP. Malgre ke posibilite sa a toujou bezwen teste dirèkteman, rezilta anvan yo sipòte ke transpò seramid ki gen chèn asil long lan nan kò Golgi a pa fèt pa pwoteyin transfè sitoplasmik, men depann de sentèz lank GPI tankou ledven. Se poutèt sa, mekanis konsèvatif evolisyonè a sanble kapab ko-transpòte seramid ki gen chèn asil trè long ak GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) selektivman nan menm vesikil transpò a.
Nan sistèm selil epitelyal polarize ledven ak mamifè yo, agregasyon ak separasyon GPI-AP ak lòt pwoteyin manbràn plasma yo tout rive anvan yo rive sou sifas selil la. Paladino et al. (48) te jwenn ke sou TGN selil epitelyal polarize mamifè yo, gwoupman GPI-AP yo pa sèlman nesesè pou klasifikasyon selektif GPI-AP yo nan manbràn plasma apikal la, men tou li kontwole òganizasyon gwoupman GPI-AP yo ak aktivite byolojik li. Sifas selilè. Nan ledven, etid sa a te montre ke gwoupman GPI-AP ki depann de seramid C26 sou ER a ka kontwole òganizasyon gwoupman ak aktivite fonksyonèl GPI-AP sou manbràn plasma a (24, 49). An akò ak modèl sa a, selil GhLag1 yo alèjik ak inibitè GPI oswa dwòg ki afekte entegrite miray selilè a (28), epi bezwen pou gwoupman Gas1-GFP fonksyonèl (49) nan pwent seramid ki projeté nan kwazman selil ledven yo endike G Posib konsekans fizyolojik selil hLag1 yo. Erè GPI-AP. Sepandan, nan pwochen rechèch nou yo, nou pral fè plis tès pou konnen si òganizasyon fonksyonèl sifas selilè a te pwograme apati RE a pa yon metòd klasman ki baze sou longè lipid.
Souch Saccharomyces cerevisiae yo itilize nan travay sa a nan Tablo S1. Souch MMY1583 ak MMY1635 SCLIM yo pou imaj selil vivan yo te konstwi nan background W303 la. Souch sa yo ki eksprime Sec13-mCherry ak yon etikèt pwoteyin fliyoresan yo te konstwi lè l sèvi avèk yon metòd ki baze sou reyaksyon an chèn polimeraz (PCR) ak plasmid pFA6a kòm yon modèl (23). Souch ki eksprime Mid2-iRFP ki make ak pwoteyin fliyoresan anba kontwòl pwomotè GAL1 la te konstwi jan sa a. Anplifikasyon PCR sekans iRFP-KanMx ki soti nan vektè pKTiRFP-KAN (kado E. O'Shea, plasmid Addgene nimewo 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; idantifyan resous rechèch (RRID): Addgene_64687) Epi mete nan C-tèminal Mid2 andojèn nan. Apre yo te fin anplifye sekans jenòm Mid2-iRFP a epi klone li nan pwomotè GAL1 la, yo te entegre li nan sit Not I-Sac I plasmid entegrasyon pRS306 la. Yo te linearize plasmid pRGS7 ki te sòti a avèk Pst I pou entegre li nan lokis URA3 la.
Jèn fizyon Gas1-GFP a eksprime anba kontwòl pwomotè GAL1 la nan plasmid santromè (CEN) lan, ki konstwi jan sa a. Sekans Gas1-GFP a te anplifye pa PCR apati plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (kado L. Popolo) epi li te klone nan sit Xma I-Xho I nan plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (kado C). Miller; plasmid Addgene nimewo 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid ki te sòti a te rele pRGS6. Jèn fizyon Axl2-GFP a eksprime tou anba kontwòl pwomotè GAL1 nan vektè pBEVY-GL LEU2 a, epi konstriksyon li se jan sa a. Yo te anplifye sekans Axl2-GFP a soti nan plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) pa PCR, epi yo te klone li nan sit Bam HI-Pst I vektè pBEVY-GL LEU2 la. Yo te rele plasmid ki te sòti a pRGS12. Sekans oligonikleotid yo itilize nan etid sa a nan Tablo S2.
Yo te ajoute 0.2% adenin ak 2% glikoz [YP-dekstròz (YPD)] nan souch lan, 2% rafinoz [YP-rafinoz] nan yon mwayen pwoteyin ekstrè ledven rich ak ekstrè ledven (YP) (1% ekstrè ledven ak 2% pwoteyin ekstrè (YPR)) oubyen 2% galaktoz [YP-galaktoz (YPG)] kòm sous kabòn, oubyen nan yon mwayen sentetik minimòm (0.15% baz nitwojèn ledven ak 0.5% silfat amonyòm) pou konplete asid amine ak baz ki nesesè pou nitrisyon, epi yo te ajoute 2% glikoz (mwayen sentetik minimòm glikoz) oubyen 2% galaktoz (mwayen sentetik minimòm galaktoz) kòm sous kabòn.
Pou imajri an tan reyèl, selil mutant sec31-1 sansib a tanperati ki eksprime konstriksyon an anba pwomotè GAL1 la te kiltive nan yon mwayen YPR a 24°C pandan tout lannwit lan rive nan faz mitan-logaritèk la. Apre endiksyon nan YPG a 24°C pandan 1 èdtan, selil yo te enkube nan SG a 37°C pandan 30 minit, epi answit transfere nan 24°C pou yo te libere nan blòk sekresyon an. Konkanavalin A te itilize pou fikse selil yo sou yon lam vè epi yo te pran imaj yo pa SCLIM. SCLIM se yon konbinezon mikwoskòp fliyoresans envèse Olympus IX-71 ak lantiy lwil oliv ouvèti nimerik UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), eskanè konfokal disk wotasyon gwo vitès ak gwo rapò siyal-bri (Yokogawa Electric), espektwomèt koutim, ak refwadisman koutim. Entansifikatè imaj sistèm lan (Hamamatsu Photonics) ka bay yon sistèm lantiy agrandisman ak yon agrandisman final × 266.7 ak yon kamera aparèy chaj-makonnen ki miltipliye elektwon yo (Hamamatsu Photonics) (21). Akizisyon imaj la fèt pa lojisyèl koutim (Yokogawa Electric). Pou imaj 3D yo, nou te itilize yon aktuatè pyezoelektrik ki fèt espesyalman pou fè lantiy objektif la vibre vètikalman, epi nou te kolekte pati optik yo 100 nm apa nan yon pil. Imaj Z-stack la konvèti an done voxel 3D, epi fonksyon dispèsyon pwen teyorik ki itilize pou mikwoskòp konfokal disk wotasyon an itilize pou pwosesis dekonvolisyon pa lojisyèl Volocity (PerkinElmer). Yo te itilize lojisyèl Volocity pou otomatikman defini papòt pou analiz ko-lokalizasyon an, epi yo te mezire ERES ki gen ladan kago a. Yo te fè analiz eskanè liy lan avèk lojisyèl MetaMorph (Molecular Devices).
Sèvi ak lojisyèl GraphPad Prism pou detèmine siyifikasyon estatistik la. Pou tès t Student bilateral la ak tès analiz varyans unidireksyonèl òdinè (ANOVA), diferans ki genyen ant gwoup yo konsidere kòm gen yon enpak siyifikatif sou P <0.05 (*).
Pou mikwoskopi fliyoresans Gas1-GFP a, selil faz logaritmik yo te grandi nan YPD pandan lannwit epi yo te kolekte yo pa santrifijasyon, yo te lave yo de fwa avèk saline tampon fosfat, epi yo te enkube yo sou glas pandan omwen 15 minit, epi answit yo te kontinye anba mikwoskòp la jan sa dekri deja nan Check (24). Mikwoskòp Leica DMi8 la (HCX PL APO 1003/1.40 lwil PH3 CS) ekipe ak yon lantiy objektif, yon filtè L5 (GFP), yon kamera Hamamatsu ak yon lojisyèl Application Suite X (LAS X) te itilize pou akizisyon an.
Echantiyon yo te denatire ak yon tanpon echantiyon SDS a 65°C pandan 10 minit, epi answit yo te separe pa elektwoforèz jèl SDS-poliakrilamid (PAGE). Pou analiz imunoblotting, yo te chaje 10 μl echantiyon pou chak liy. Antikò prensipal: Itilize poliklonal lapen anti-Gas1 nan yon dilisyon 1:3000, poliklonal lapen anti-Emp24 nan yon dilisyon 1:500, ak poliklonal lapen anti-GFP (yon kado H. Riezman) nan yon dilisyon 1:3000. Yo te itilize antikò monoklonal sourit anti-Pgk1 la nan yon dilisyon 1:5000 (yon kado J. de la Cruz). Antikò segondè: Imunoglobulin G (IgG) kabrit anti-lapen konjige ak peroksidaz raifò (HRP) itilize nan yon dilisyon 1:3000 (Pierce). Yo te itilize IgG kabrit anti-souris konjige ak HRP nan yon dilisyon 1:3000 (Pierce). Yo te obsève zòn repons iminitè a avèk metòd chimiluminesans reyaktif SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Jan sa dekri nan (31), yo te fè yon eksperyans imunopresipitasyon natirèl sou fraksyon ER anrichi a. An brèf, lave selil ledven yo ak yon tanpon TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fliyò ak yon melanj inibitè pwoteaz) a 600 nm (OD600) nan yon dansite optik 100 de fwa. Yo te kase l ak pèl an vè, epi answit yo te retire debri selilè yo ak pèl an vè yo pa santrifijasyon. Apre sa, yo te santrifije sipènatan an a 17,000 g pandan 15 minit a 4°C. Yo te resispann grenn nan nan TNE epi yo te ajoute saponin dijital nan yon konsantrasyon final 1%. Yo te enkube sispansyon an pandan 1 èdtan avèk wotasyon a 4°C, epi answit yo te retire konpozan ensolub yo pa santrifijasyon a 13,000 g a 4°C pandan 60 minit. Pou imunoprecipitasyon Gas1-GFP a, premyèman pre-enkube echantiyon an ak pèl agaroz vid (ChromoTek) a 4°C pandan 1 èdtan, epi answit enkube ak GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C pandan 3 èdtan. Pèl imunoprecipite yo te lave senk fwa ak TNE ki gen 0.2% digoksijenin, elye ak tanpon echantiyon SDS, separe sou SDS-PAGE, epi analize pa imunoblotting.
Jan sa dekri nan (31), yo te fè detèminasyon kwa-lyezon sou fraksyon ER anrichi a. An brèf, yo te enkube fraksyon ER anrichi a avèk 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Yo te etenn reyaksyon kwa-lyezon an lè yo te ajoute glisin (50 mM konsantrasyon final, 5 minit, 20°C).
Jan sa te dekri deja (50), yo te fè analiz MS seramid nan souch sovaj ak GhLag1. An brèf, yo te kiltive selil yo rive nan faz eksponansyèl (3 a 4 inite OD600/ml) nan YPD a 30°C, epi yo te rekòlte 25×107 selil. Yo te etenn metabolis yo ak asid trichloracetic. Sèvi ak yon sòlvan ekstraksyon [etanòl, dlo, etè, piridin ak 4.2 N idroksid amonyòm (15:15:5:1:0.018 v/v)] ak 1.2 nmol seramid C17 estanda entèn (860517, Avanti polar lipid)). Sèvi ak reyaktif monometilamin [metanòl, dlo, n-butanòl ak solisyon metilamin (4:3:1:5 v/v)] pou fè yon idwoliz alkalin modere nan ekstrè a, epi answit sèvi ak n-butanòl satire ak dlo pou desalye li. Finalman, yo te resispann ekstrè a nan yon solvan mòd pozitif [klorofòm/metanòl/dlo (2:7:1) + 5 mM asetat amonyòm] epi yo te enjekte li nan espektwomèt mas la. Yo te fè siveyans milti-reyaksyon (MRM) pou idantifikasyon ak quantifikasyon molekil sfingolipid yo. Espektwomèt mas kwadripòl tersiè TSQ Vantage la (Thermo Fisher Scientific) ekipe ak yon sous iyon nanoflu robotik Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pou analiz lipid. Enèji kolizyon an optimize pou chak kategori seramid. Yo te jwenn done MS yo nan mòd pozitif. Pou chak replikasyon byolojik, siyal lipid la se medyàn twa mezi endepandan.
Jan sa dekri nan (31), selil yo (800 × 107) ki eksprime Gas1-GFP yo te sibi imunopresipitasyon natirèl. Gas1-GFP pirifye a te separe pa SDS-PAGE epi transfere nan yon manbràn polivinilidèn fliyò (PVDF). Pwoteyin nan te vizyalize lè yo te kolore PVDF ak nwa amid. Bann Gas1-GFP a te koupe nan PVDF la epi lave 5 fwa ak metanol epi yon fwa ak dlo klas kromatografi likid-MS (LC-MS). Lè yo enkube bann manbràn lan ak 500 μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), yon tanpon ak 500 μl melanj nitrit sodyòm 1 M ki fèk fonn a 37 °C pandan 3 èdtan, fraksyon lipid la libere nan Gas1-GFP epi lize Liberasyon seramid fosfat inozin ant glikozamin ak inositol (51). Apre sa, yo te lave bann manbràn lan kat fwa avèk dlo klas LC-MS, yo te seche l nan tanperati chanm, epi yo te estoke l nan yon atmosfè nitwojèn a -80°C jiskaske yo te fè analiz la. Kòm yon kontwòl, yo te itilize yon echantiyon vid manbràn PVDF pou chak eksperyans. Yo te analize lipid yo te ekstrè nan Gas1-GFP a pa MS jan yo te dekri a (50). An brèf, yo te resispann bann PVDF ki gen GPI-lipid nan 75μl sòlvan mwazi negatif [klorofòm/metanòl (1:2) + 5 mM asetat amonyòm] epi yo te pase analiz iyonizasyon elektwosprey (ESI)-MRM/MS espès sfingolipid yo (TSQ Vantage). Nan ka sa a, yo te jwenn done MS yo nan mòd iyon negatif.
Jan nou te mansyone pi bonè, yo te separe pòsyon lipid lank GPI a ak GPI-AP ki make ak [3H]-inozitol la (16). Yo te separe lipid yo pa kromatografi kouch mens lè l sèvi avèk yon sistèm sòlvan (55:45:10 klorofòm-metanòl-0.25% KCl) epi yo te vizyalize yo lè l sèvi avèk FLA-7000 (Fujifilm).
Selil ki eksprime Gas1-GFP (600×107) yo te lave de fwa avèk tanpon TNE avèk tanpon TNE, epi yo te kase yo ak pèl an vè, epi answit santrifije yo pou retire debri selilè ak pèl an vè. Apre sa, yo te santrifije sipènatant la a 17,000 g pandan 1 èdtan a 4°C. Yo te lave pelet la nan TNE epi yo te enkube l avèk 1 U PI-PLC (Invitrogen) nan TNE ki gen 0.2% saponin dijital pandan 1 èdtan a 37°C. Apre tretman anzim lan, yo te retire manbràn nan pa santrifijasyon a 17,000 g a 4°C pandan 1 èdtan. Pou imunoprecipite Gas1-GFP a, yo te enkube sipènatant la avèk GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C pandan tout lannwit lan. Gas1-GFP pirifye a ki te separe pa SDS-PAGE te kolore avèk ble briyan Coomassie. Yo te koupe bann koloran Gas1-GFP a nan gri ki antoure akiduk la, epi apre alkilasyon ak iyodoasetamid ak rediksyon ak ditiyotritol, yo te fè dijesyon nan jèl ak tripsin. Ekstrè epi seche peptid triptik yo ak peptid yo ak GPI-glikan. Yo te fonn peptid seche a nan 20 μl dlo. Enjekte yon pòsyon (8 μl) nan LC a. Yo te itilize yon kolòn oktadesilsilan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; dyamèt enteryè 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japon) pou separe peptid yo anba kondisyon gradyan espesifik. Faz mobil lan se sòlvan A (0.08% asid formik) ak sòlvan B (0.15% asid formik nan 80% asetonitril). Yo te itilize yon sistèm Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) pou elimine kolòn nan avèk sòlvan A nan 55 minit nan yon vitès koule 50 μl min-1 pandan 5 minit, epi answit yo te ogmante konsantrasyon sòlvan B a a 40%. , Etazini). Yo te entwodui eli a kontinyèlman nan sous iyon ESI a, epi yo te analize peptid triptik yo ak peptid ki gen GPI-glikan yo avèk LTQ Orbitrap XL (espektwomèt mas ibrid lineyè pyèj iyon-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Nan konfigirasyon MS la, yo te fikse vòltaj sous kapilè a a 4.5 kV, epi yo te kenbe tanperati kapilè transfè a a 300°C. Yo te fikse vòltaj kapilè a ak vòltaj lantiy tib la a 15 V ak 50 V, respektivman. Yo te jwenn done MS yo nan mòd iyon pozitif (rezolisyon 60,000; presizyon mas 10 pati pa milyon) nan yon seri mas 300/m/z rapò mas/chaj (m/z) 3000. Yo jwenn done MS/MS yo atravè pyèj iyon ki nan LTQ Orbitrap XL la [3 premye chif yo sou ki done yo depann, disosyasyon pwovoke pa kolizyon (CID)].
Similasyon MD yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl GROMACS (52) ak chan fòs MARTINI 2 (53-55). Apre sa, yo te itilize CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) pou konstwi yon bikouch ki genyen dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) ak Cer C18 oubyen DOPC ak Cer C26. Topoloji ak kowòdone Cer C26 yo sòti nan DXCE lè yo retire pèl anplis yo nan ke sfingozin nan. Sèvi ak pwosesis ki dekri anba a pou balanse doub kouch la epi fè l fonksyone, answit sèvi ak dènye kowòdone sistèm nan pou konstwi yon sistèm ki genyen Emp24. Domèn transmembranè ledven Emp24 la (rezid 173 a 193) te konstwi kòm yon α-eliks lè l sèvi avèk estrikti molekilè zouti vizyèl MD (VMD) la (58). Apre sa, apre yo te retire lipid ki sipèpoze yo, yo te granule pwoteyin nan yon fason koryas epi yo te mete l nan bikouch la lè l sèvi avèk CHARMM GUI. Sistèm final la gen ladan l 1202 DOPC ak 302 Cer C26 oubyen 1197 DOPC ak 295 Cer C18 ak Emp24. Iyonize sistèm nan a yon konsantrasyon 0.150M. Kat replikasyon endepandan te fèt pou de konpozisyon bikouch.
Yo balanse doub kouch lipid la lè l sèvi avèk pwosesis CHARMM GUI a, ki enplike minimize epi balanse 405,000 etap, kote yo diminye epi elimine kontrent pozisyon yo piti piti, epi yo ogmante etap tan an soti nan 0.005 ps pou rive nan 0.02 ps. Apre ekilibrasyon an, li pwodui 6 µs ak yon etap tan 0.02 ps. Apre yo fin mete Emp24, sèvi ak menm pwosesis CHARMM GUI a pou minimize epi balanse sistèm nan, epi answit kouri l pandan 8 s an pwodiksyon.
Pou tout sistèm yo, pandan pwosesis balans lan, presyon an kontwole pa barostat Berendsen an (59), epi pandan pwosesis pwodiksyon an, presyon an kontwole pa barostat Parrinello-Rahman an (60). Nan tout ka yo, presyon mwayèn nan se 1 bar epi yo itilize yon konplo kouplaj presyon semi-izotropik. Nan pwosesis balans lan ak pwodiksyon an, yo itilize yon tèmosta (61) ak rekalibrasyon vitès pou kouple tanperati pwoteyin, lipid ak patikil sòlvan respektivman. Pandan tout operasyon an, tanperati sib la se 310K. Entèraksyon ki pa lyezon an kalkile lè yo jenere yon lis pè lè l sèvi avèk konplo Verlet la ak yon tolerans tampon 0.005. Tèm Coulomb la kalkile lè l sèvi avèk chan reyaksyon an ak yon distans koupe 1.1 nm. Tèm Vander Waals la itilize yon konplo koupe ak yon distans koupe 1.1 nm, epi yo itilize konplo koupe Verlet la pou derive potansyèl la (62).
Lè w ap itilize VMD, longèdonn koupe ant pèl fosfat DOPC yo oswa pèl seramid AM1 yo ak pwoteyin nan se 0.7 nm, epi yo kalkile kantite lipid ki kominike avèk pwoteyin nan. Selon fòmil sa a, kalkile faktè rediksyon-anrichisman (DE) a jan sa endike nan (63): Faktè DE = (kantite lipid total nan pwoteyin nan 0.7) nan pwoteyin nan 0.7 (kantite Cer nan lipid total yo)
Valè ki rapòte a jwenn kòm yon mwayèn, epi ba erè yo se kat kopi endepandan SE. Siyifikasyon estatistik faktè DE a kalkile pa tès t [(mwayèn-faktèDE-1)/SE]. Kalkile valè P a apati distribisyon unilateral la.
Yo te itilize zouti GROMACS la pou kalkile kat dansite lateral 2D sistèm ki gen Emp24 la nan dènye 250 ns tras la. Pou jwenn kat anrichisman/rediksyon seramid la, yo divize kat dansite Cer la pa sòm kat Cer ak DOPC la, epi answit divize pa konsantrasyon Cer nan kò a. Yo itilize menm echèl kat koulè a.
Pou plis materyèl pou atik sa a, tanpri gade http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Sa a se yon atik aksè ouvè distribye anba kondisyon Lisans Atribisyon-Non-Komèsyal Creative Commons lan, ki pèmèt itilizasyon, distribisyon ak repwodiksyon nan nenpòt mwayen, depi itilizasyon final la pa pou benefis komèsyal epi prensip la se ke travay orijinal la kòrèk. Referans.
Nòt: Nou sèlman mande w pou w bay adrès imel ou pou moun ou rekòmande sou paj la ka konnen ou vle yo wè imel la epi li pa spam. Nou p ap pran okenn adrès imel.
Kesyon sa a sèvi pou teste si ou se yon vizitè epi pou anpeche soumèt spam otomatik.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Arman Miho Waga (Misko Lopez), Arman Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imaj 3D an tan reyèl ak gwo rezolisyon revele enpòtans longè chèn seramid pou klasman pwoteyin nan sit pwodiksyon selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Arman Miho Waga (Misko Lopez), Arman Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imaj 3D an tan reyèl ak gwo rezolisyon revele enpòtans longè chèn seramid pou klasman pwoteyin nan sit pwodiksyon selektif.
©2020 Asosyasyon Ameriken pou Avansman Syans. tout dwa rezève. AAAS se yon patnè HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ak COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.