Nou te rapòte deja ke nivo serik metabolit triptofan ki sòti nan trip la, asid indol-3-propyonik (IPA), pi ba nan pasyan ki gen fibwoz fwa. Nan etid sa a, nou te envestige transkriptòm ak metilòm ADN nan fwa obèz an relasyon ak nivo IPA serik, ansanm ak wòl IPA nan pwovoke inaktivasyon fenotipik selil estele epatik (HSC) in vitro.
Etid la te gen ladan 116 pasyan obèz san dyabèt tip 2 (T2DM) (laj 46.8 ± 9.3 ane; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) ki te sibi operasyon baryatrik nan Sant Chiriji Baryatrik Kuopio (KOBS). Nivo IPA sikilant yo te mezire pa kromatografi likid-espektrometri mas (LC-MS), analiz transkriptòm fwa a te fèt pa sekansaj ARN total, epi analiz metilasyon ADN te fèt lè l sèvi avèk Infinium HumanMethylation450 BeadChip la. Selil stellate epatik imen (LX-2) yo te itilize pou eksperyans in vitro.
Nivo IPA nan sewòm yo te korele ak ekspresyon jèn ki enplike nan chemen apoptotik, mitofajik, ak lonjevite nan fwa a. Jèn AKT serin/treonin kinaz 1 (AKT1) la te jèn entèraksyon ki pi abondan ak dominan nan transkripsyon fwa a ak pwofil metilasyon ADN. Tretman IPA a te pwovoke apoptoz, diminye respirasyon mitokondriyal, epi modifye mòfoloji selilè ak dinamik mitokondriyal lè li te modulation ekspresyon jèn ki li te ye pou kontwole fibwoz, apoptoz, ak siviv selil LX-2 yo.
Lè nou mete tout done sa yo ansanm, nou kwè IPA gen potansyèl pou fè efè terapetik epi li ka pwovoke apoptoz epi chanje fenotip HSC a nan yon eta inaktif, kidonk li ogmante posiblite pou anpeche fibwoz fwa a lè li entèfere ak aktivasyon HSC ak metabolis mitokondriyal.
Prevalans obezite ak sendwòm metabolik la asosye avèk yon ogmantasyon nan maladi fwa gra ki asosye ak metabolis (MASLD); maladi a afekte 25% a 30% nan popilasyon jeneral la [1]. Konsekans prensipal etioloji MASLD a se fibwoz fwa, yon pwosesis dinamik ki karakterize pa yon akimilasyon kontinyèl matris ekstraselilè fibrou (ECM) [2]. Selil prensipal ki enplike nan fibwoz fwa a se selil estele epatik (HSC), ki montre kat fenotip li te ye: ki pa aktif, aktive, inaktive, ak senesan [3, 4]. HSC yo ka aktive epi transdiferansye soti nan yon fòm ki pa aktif nan selil ki sanble ak fibroblas proliferatif ki gen gwo demand enèji, ak yon ekspresyon ogmante nan α-aktin misk lis (α-SMA) ak kolagen tip I (Col-I) [5, 6]. Pandan ranvèsman fibwoz fwa a, HSC aktive yo elimine atravè apoptoz oswa inaktivasyon. Pwosesis sa yo enkli diminisyon jèn fibwojèn yo ak modilasyon jèn prosivivans (tankou chemen siyalizasyon NF-κB ak PI3K/Akt) [7, 8], ansanm ak chanjman nan dinamik ak fonksyon mitokondriyal yo [9].
Yo jwenn nivo serik metabolit triptofan an, asid indol-3-propyonik (IPA), ki pwodui nan trip la, diminye nan maladi metabolik imen tankou MASLD [10-13]. IPA asosye avèk konsomasyon fib dyetetik, li konnen pou efè antioksidan ak anti-enflamatwa li yo, epi li diminye fenotip steatoepatit ki pa gen alkòl (NASH) ki pwovoke pa rejim alimantè a in vivo ak in vitro [11-14]. Gen kèk prèv ki soti nan etid anvan nou an, ki te demontre ke nivo IPA serik yo te pi ba nan pasyan ki gen fibwoz fwa pase nan pasyan obèz san fibwoz fwa nan Etid Chiriji Baryatrik Kuopio (KOBS). Anplis de sa, nou te montre ke tretman IPA a te kapab diminye ekspresyon jèn ki se makè klasik adezyon selilè, migrasyon selilè ak aktivasyon selil souch ematopoyetik nan yon modèl selil estele epatik imen (LX-2) epi li se yon metabolit epatoprotektè potansyèl [15]. Sepandan, li rete enkoni kijan IPA pwovoke regresyon fibwoz fwa lè li aktive apoptoz HSC ak byoenèji mitokondriyal.
La a, nou demontre ke IPA nan sewòm asosye avèk ekspresyon jèn ki rich nan apoptoz, mitofaji, ak chemen lonjevite nan fwa moun ki obèz men ki pa gen dyabèt tip 2 (KOBS). Anplis de sa, nou te jwenn ke IPA ka pwovoke eliminasyon ak degradasyon selil souch ematopoyetik aktive (HSC) atravè chemen inaktivasyon an. Rezilta sa yo revele yon nouvo wòl pou IPA, sa ki fè li yon sib terapetik potansyèl pou ankouraje regresyon fibwoz fwa.
Yon etid anvan nan gwoup KOBS la te montre ke pasyan ki gen fibwoz fwa te gen pi ba nivo IPA sikile nan san yo konpare ak pasyan ki pa gen fibwoz fwa [15]. Pou eskli potansyèl efè konfizyon dyabèt tip 2 a, nou te rekrite 116 pasyan obèz san dyabèt tip 2 (laj mwayèn ± SD: 46.8 ± 9.3 ane; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tablo 1) nan etid KOBS ki an kou a kòm popilasyon etid la [16]. Tout patisipan yo te bay konsantman enfòme alekri epi pwotokòl etid la te apwouve pa Komite Etik Lopital Konte North Savo a an akò ak Deklarasyon Helsinki (54/2005, 104/2008 ak 27/2010).
Yo te pran echantiyon byopsi fwa pandan operasyon baryatrik epi patolojis ki gen eksperyans te evalye yo istolojikman dapre kritè ki te dekri deja [17, 18]. Kritè evalyasyon yo rezime nan Tablo Siplemantè S1 epi yo te dekri deja [19].
Yo te analize echantiyon serom a jeun yo pa kromatografi likid san sib-espektrometri mas (LC-MS) pou analiz metabolomik (n = 116). Yo te analize echantiyon yo lè l sèvi avèk yon sistèm UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Almay) jan yo te dekri deja19. Idantifikasyon alkòl izopropilik (IPA) te baze sou tan retansyon ak konparezon spectre MS/MS la ak estanda pi yo. Yo te konsidere entansite siyal IPA a (zòn pik) nan tout analiz ki vin apre yo [20].
Yo te fè sekans ARN fwa konplè a avèk Illumina HiSeq 2500 epi yo te pretrete done yo jan yo te dekri sa deja [19, 21, 22]. Nou te fè analiz ekspresyon diferansyèl siblé sou transkripsyon ki afekte fonksyon mitokondriyal/byojenèz la avèk 1957 jèn yo te chwazi nan baz done MitoMiner 4.0 la [23]. Yo te fè analiz metilasyon ADN fwa a avèk Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) avèk menm metodoloji yo te dekri sa deja [24, 25].
Pwofesè Stefano Romeo te jantiman bay selil zetwal epatik imen (LX-2) epi yo te kiltive epi konsève nan yon mwayen DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Pou chwazi dòz IPA ki apwopriye a, selil LX-2 yo te trete ak diferan konsantrasyon IPA (10 μM, 100 μM ak 1 mM; Sigma, 220027) nan mwayen DMEM/F12 pandan 24 èdtan. Anplis de sa, pou envestige kapasite IPA pou inaktive HSC yo, selil LX-2 yo te ko-trete ak 5 ng/ml TGF-β1 (sistèm R&D, 240-B-002/CF) ak 1 mM IPA nan yon mwayen san serom pandan 24 èdtan. Pou kontwòl veyikil korespondan yo, yo te itilize 4 nM HCL ki gen 0.1% BSA pou tretman TGF-β1 epi yo te itilize 0.05% DMSO pou tretman IPA, epi yo te itilize tou de ansanm pou tretman konbinezon an.
Yo te evalye apoptoz la lè l sèvi avèk Twous Deteksyon Apoptoz FITC Annexin V ak 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) dapre enstriksyon manifakti a. An brèf, yo te kiltive LX-2 (1 × 105 selil/pi) pandan tout lannwit nan plak 12 pi epi answit yo te trete yo ak plizyè dòz IPA oswa IPA ak TGF-β1. Nan jou ki te swiv la, yo te kolekte selil k ap flote ak selil adezif yo, yo te tripsinize yo, yo te lave yo ak PBS, yo te resispann yo nan tanpon lyezon Annexin V, epi yo te enkube yo ak FITC-Annexin V ak 7-AAD pandan 15 minit.
Yo te kolore mitokondri nan selil vivan yo pou aktivite oksidatif lè l sèvi avèk Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Pou tès MTR yo, yo te enkube selil LX-2 yo nan dansite egal ak IPA ak TGF-β1. Apre 24 èdtan, yo te tripsinize selil vivan yo, yo te lave yo ak PBS, epi answit yo te enkube yo ak 100 μM MTR nan yon mwayen san serom a 37 °C pandan 20 minit jan sa te dekri deja [26]. Pou analiz mòfoloji selil vivan yo, yo te analize gwosè selil la ak konpleksite sitoplasmik la lè l sèvi avèk paramèt dispèsyon forward (FSC) ak dispèsyon lateral (SSC), respektivman.
Tout done yo (30,000 evènman) te jwenn lè l sèvi avèk NovoCyte Quanteon (Agilent) epi yo te analize yo lè l sèvi avèk lojisyèl NovoExpress® 1.4.1 oswa FlowJo V.10.
Yo te mezire to konsomasyon oksijèn (OCR) ak to asidifikasyon ekstraselilè (ECAR) an tan reyèl lè l sèvi avèk yon Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ekipe ak yon Seahorse XF Cell Mito Stress dapre enstriksyon manifakti a. An brèf, yo te simen 2 × 104 selil LX-2/pi sou plak kilti selilè XF96. Apre enkubasyon lannwit lan, yo te trete selil yo ak izopropanol (IPA) ak TGF-β1 (Metòd Siplemantè 1). Yo te fè analiz done yo lè l sèvi avèk lojisyèl Seahorse XF Wave, ki gen ladan Dèlko Rapò Tès Fenotip Enèji Selilè Seahorse XF la. Apati de sa, yo te kalkile yon Endis Sante Byoenèjik (BHI) [27].
Yo te transkri ARN total la an ADNc. Pou metòd espesifik yo, gade referans [15]. Yo te itilize nivo ARNm pwoteyin asid ribozomal 60S P0 (RPLP0) ak siklofilin A1 (PPIA) kòm kontwòl jèn konstititif. Yo te itilize Sistèm PCR an tan reyèl QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Peyi Ba yo) avèk Kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) oswa Kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), epi yo te kalkile pliye ekspresyon jèn relatif la lè l sèvi avèk paramèt siklaj valè Ct konparatif (ΔΔCt) ak metòd ∆∆Ct la. Detay sou primè yo bay nan Tablo Siplemantè S2 ak S3.
Yo te ekstrè ADN nikleyè (ADNnc) ak ADN mitokondriyal (ADNmt) lè l sèvi avèk twous DNeasy pou san ak tisi (Qiagen) jan sa te dekri deja [28]. Yo te kalkile kantite relatif ADNmt la lè yo te kalkile rapò chak rejyon ADNmt sib ak mwayèn jewometrik twa rejyon ADN nikleyè yo (ADNmt/ADNnc), jan sa detaye nan Metòd Siplemantè 2. Detay sou primè pou ADNmt ak ADNnc yo bay nan Tablo Siplemantè S4.
Selil vivan yo te kolore ak Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) pou vizyalize rezo mitokondriyal entèselilè ak entraselilè. Selil LX-2 yo (1 × 104 selil/pi) te kiltive sou lam vè nan plak kilti ki gen fon vè korespondan (Ibidi GmbH, Martinsried, Almay). Apre 24 èdtan, selil LX-2 vivan yo te enkube ak 100 μM MTR pandan 20 minit a 37 °C epi nwayo selil yo te kolore ak DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) jan sa dekri deja [29]. Rezo mitokondriyal yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon mikwoskòp envèse Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almay) ekipe ak yon modil konfokal Zeiss LSM 800 a 37 °C nan yon atmosfè imid ak 5% CO2 lè l sèvi avèk yon objektif 63×NA 1.3. Nou te akeri dis imaj seri Z pou chak kalite echantiyon. Chak seri Z gen 30 seksyon, chak ak yon epesè 9.86 μm. Pou chak echantiyon, yo te pran imaj dis chan vizyon diferan lè l sèvi avèk lojisyèl ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almay), epi yo te fè analiz mòfoloji mitokondriyal la lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ (v1.54d) [30, 31] dapre paramèt ki detaye nan Metòd Siplemantè 3.
Selil yo te fikse ak 2% glutaraldeyid nan 0.1 M tanpon fosfat, apre sa yo te fikse yo ak 1% solisyon tetroksid osmiyòm (Sigma Aldrich, MO, Etazini), yo te dezidrate yo piti piti ak asetòn (Merck, Darmstadt, Almay), epi finalman yo te entegre yo nan rezin epoksi. Yo te prepare seksyon ultramens epi yo te kolore yo ak 1% asetat uranil (Merck, Darmstadt, Almay) ak 1% sitrat plon (Merck, Darmstadt, Almay). Yo te jwenn imaj ultrastriktirèl yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elektwonik transmisyon JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japon) nan yon vòltaj akselerasyon 80 kV.
Yo te analize mòfoloji selil LX-2 yo ki te trete ak IPA pandan 24 èdtan pa mikwoskòp kontras faz nan yon agrandisman 50x lè l sèvi avèk yon mikwoskòp limyè envèse Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 ak AxioCam MRm, Jena, Almay).
Done klinik yo te eksprime kòm mwayèn ± devyasyon estanda oswa medyàn (ranje entèkatil: IQR). Yo te itilize analiz varyans yon sèl chemen (varyab kontinyèl) oswa tès χ² (varyab kategorik) pou konpare diferans ki genyen ant twa gwoup etid yo. Yo te itilize to fo pozitif (FDR) la pou korije tès miltip, epi yo te konsidere jèn ki gen FDR < 0.05 kòm estatistikman siyifikatif. Yo te itilize analiz korelasyon Spearman pou korele metilasyon ADN CpG ak entansite siyal IPA a, avèk valè p nominal (p < 0.05) rapòte.
Yo te fè analiz chemen yo lè l sèvi avèk yon zouti analiz jèn sou entènèt (WebGestalt) pou 268 transkripsyon (nominal p < 0.01), 119 transkripsyon ki asosye ak mitokondri (nominal p < 0.05), ak 4350 CpG sou 3093 transkripsyon fwa ki te asosye ak nivo IPA ki sikile nan san an. Yo te itilize zouti Venny DB (vèsyon 2.1.0) ki disponib gratis la pou jwenn jèn ki sipèpoze, epi yo te itilize StringDB (vèsyon 11.5) pou vizyalize entèraksyon pwoteyin-pwoteyin.
Pou eksperyans LX-2 a, echantiyon yo te teste pou nòmalite lè l sèvi avèk tès D'Agostino-Pearson an. Done yo te jwenn nan omwen twa replikasyon byolojik epi yo te sibi ANOVA yon sèl chemen ak tès Bonferroni post hoc. Yon valè p mwens pase 0.05 te konsidere kòm estatistikman siyifikatif. Done yo prezante kòm mwayèn ± SD, epi kantite eksperyans yo endike nan chak figi. Tout analiz ak graf yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl estatistik GraphPad Prism 8 pou Windows (GraphPad Software Inc., vèsyon 8.4.3, San Diego, Etazini).
Premyèman, nou te envestige asosyasyon nivo IPA nan serom ak transkripsyon fwa, kò konplè, ak mitokondri. Nan pwofil transkripsyon total la, jèn ki pi fò ki asosye ak nivo IPA nan serom se te MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; pwoteyin kinaz aktive pa mitojèn ki aktive pa kinaz pwoteyin 3); nan pwofil transkripsyon ki gen rapò ak mitokondri a, jèn ki pi fò ki asosye a se te AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serin/treonin kinaz 1) (Fichye adisyonèl 1 ak Fichye adisyonèl 2).
Apre sa, nou te analize transkripsyon global yo (n = 268; p < 0.01) ak transkripsyon ki asosye ak mitokondri yo (n = 119; p < 0.05), epi finalman nou te idantifye apoptoz kòm chemen kanonik ki pi enpòtan an (p = 0.0089). Pou transkripsyon mitokondri ki asosye ak nivo IPA nan sewòm, nou te konsantre sou apoptoz (FDR = 0.00001), mitofaji (FDR = 0.00029), ak chemen siyalizasyon TNF (FDR = 0.000006) (Figi 1A, Tablo 2, ak Figi Siplemantè 1A-B).
Analiz sipèpoze transkripsyon global ki asosye ak mitokondri, ak metilasyon ADN nan fwa imen an asosyasyon ak nivo IPA serik. A reprezante 268 transkripsyon global, 119 transkripsyon ki asosye ak mitokondri, ak transkripsyon ADN metile ki mape nan 3092 sit CpG ki asosye ak nivo IPA serik (valè p < 0.01 pou transkripsyon global ak ADN metile, ak valè p < 0.05 pou transkripsyon mitokondri). Pi gwo transkripsyon sipèpoze yo montre nan mitan an (AKT1 ak YKT6). B Kat entèraksyon 13 jèn ki gen pi gwo nòt entèraksyon an (0.900) ak lòt jèn yo te konstwi apati 56 jèn sipèpoze yo (rejyon liy nwa) ki te siyifikativman asosye ak nivo IPA serik lè l sèvi avèk zouti sou entènèt StringDB la. Vèt: Jèn ki mape nan konpozan selilè Gene Ontology (GO): mitokondri (GO:0005739). AKT1 se pwoteyin ki gen pi gwo nòt la (0.900) pou entèraksyon ak lòt pwoteyin ki baze sou done yo (dapre eksplorasyon tèks, eksperyans, baz done, ak ko-ekspresyon). Nœuds rezo yo reprezante pwoteyin, epi bor yo reprezante koneksyon ant pwoteyin yo.
Piske metabolit mikwobyota entesten yo ka kontwole konpozisyon epigenetik atravè metilasyon ADN [32], nou te envestige si nivo IPA serik yo te asosye avèk metilasyon ADN fwa. Nou te jwenn ke de sit metilasyon prensipal ki asosye avèk nivo IPA serik yo te toupre rejyon 3 ki rich an prolin-serin (C19orf55) ak fanmi pwoteyin chòk chalè B (ti) manm 6 (HSPB6) (Fichye adisyonèl 3). Metilasyon ADN 4350 CpG (p < 0.01) te korele avèk nivo IPA serik yo epi li te anrichi nan chemen regilasyon lonjevite (p = 0.006) (Figi 1A, Tablo 2, ak Figi Siplemantè 1C).
Pou nou konprann mekanis byolojik ki kache dèyè asosyasyon ant nivo IPA nan sewòm, transkripsyon global yo, transkripsyon ki asosye ak mitokondri yo, ak metilasyon ADN nan fwa imen an, nou te fè yon analiz sipèpoze sou jèn yo idantifye nan analiz chemen anvan an (Figi 1A). Rezilta analiz anrichisman chemen 56 jèn ki sipèpoze yo (andedan liy nwa a nan Figi 1A) te montre ke chemen apoptoz la (p = 0.00029) te mete aksan sou de jèn komen nan twa analiz yo: AKT1 ak YKT6 (omolog YKT6 v-SNARE), jan yo montre nan dyagram Venn lan (Figi Siplemantè 2 ak Figi 1A). Sa ki enteresan, nou te jwenn ke AKT1 (cg19831386) ak YKT6 (cg24161647) te pozitivman korele ak nivo IPA nan sewòm (Fichye adisyonèl 3). Pou idantifye entèraksyon pwoteyin potansyèl ant pwodwi jèn yo, nou te chwazi 13 jèn ki gen pi gwo nòt rejyon komen an (0.900) pami 56 jèn ki sipèpoze kòm done antre epi nou te konstwi yon kat entèraksyon. Selon nivo konfyans lan (konfyans majinal), jèn AKT1 ki te gen pi gwo nòt la (0.900) te an tèt (Figi 1B).
Baze sou analiz chemen an, nou te jwenn ke apoptoz te chemen prensipal la, kidonk nou te envestige si tretman IPA a ta afekte apoptoz HSC yo in vitro. Nou te demontre deja ke diferan dòz IPA (10 μM, 100 μM, ak 1 mM) pa t toksik pou selil LX-2 yo [15]. Etid sa a te montre ke tretman IPA a 10 μM ak 100 μM te ogmante kantite selil ki ka viv ak selil nekwotik yo. Sepandan, konpare ak gwoup kontwòl la, viabilite selil la te diminye nan konsantrasyon 1 mM IPA, pandan ke to nekwoz selilè a te rete san chanjman (Figi 2A, B). Apre sa, pou jwenn konsantrasyon optimal pou pwovoke apoptoz nan selil LX-2 yo, nou te teste 10 μM, 100 μM, ak 1 mM IPA pandan 24 èdtan (Figi 2A-E ak Figi Siplemantè 3A-B). Sa ki enteresan, IPA 10 μM ak 100 μM diminye to apoptoz la (%), sepandan, IPA 1 mM ogmante apoptoz an reta ak to apoptoz la (%) konpare ak kontwòl la e pakonsekan yo te chwazi li pou plis eksperyans (Figi 2A-D).
IPA pwovoke apoptoz selil LX-2 yo. Yo te itilize metòd doub koloran Annexin V ak 7-AAD pou mezire to apoptoz la ak mòfoloji selilè a pa sitometri koule. Yo te enkube selil BA yo ak 10 μM, 100 μM ak 1 mM IPA pandan 24 èdtan oubyen ak F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ak 1 mM IPA nan yon mwayen san serom pandan 24 èdtan. A: selil vivan (Annexin V -/ 7AAD-); B: selil nekwotik (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: bonè (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: ta (Annexin V+/7AAD.+); E, H: pousantaj total selil apoptoz bonè ak ta nan to apoptoz (%). Done yo eksprime kòm mwayèn ± SD, n = 3 eksperyans endepandan. Konparezon estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk ANOVA yon sèl chemen ak tès Bonferroni post hoc. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Jan nou te montre deja, 5 ng/ml TGF-β1 ka pwovoke aktivasyon HSC lè li ogmante ekspresyon jèn makè klasik yo [15]. Selil LX-2 yo te trete ak 5 ng/ml TGF-β1 ak 1 mM IPA an konbinezon (Fig. 2E–H). Tretman TGF-β1 pa t chanje to apoptoz la, sepandan, ko-tretman IPA a ogmante apoptoz anreta ak to apoptoz (%) konpare ak tretman TGF-β1 (Fig. 2E–H). Rezilta sa yo endike ke 1 mM IPA ka ankouraje apoptoz nan selil LX-2 endepandamman de endiksyon TGF-β1.
Nou te plis envestige efè IPA sou respirasyon mitokondriyal nan selil LX-2 yo. Rezilta yo te montre ke 1 mM IPA te diminye paramèt to konsomasyon oksijèn (OCR): respirasyon ki pa mitokondriyal, respirasyon bazal ak maksimòm, flit pwoton ak pwodiksyon ATP konpare ak gwoup kontwòl la (Figi 3A, B), pandan ke endèks sante byoenèjetik (BHI) la pa t chanje.
IPA diminye respirasyon mitokondriyal nan selil LX-2 yo. Koub respirasyon mitokondriyal la (OCR) prezante kòm paramèt respirasyon mitokondriyal (respirasyon ki pa mitokondriyal, respirasyon bazal, respirasyon maksimòm, flit pwoton, jenerasyon ATP, SRC ak BHI). Selil A ak B yo te enkube ak 10 μM, 100 μM ak 1 mM IPA pandan 24 èdtan, respektivman. Selil C ak D yo te enkube ak TGF-β1 (5 ng/ml) ak 1 mM IPA nan yon mwayen san serom pandan 24 èdtan, respektivman. Tout mezi yo te nòmalize ak kontni ADN lè l sèvi avèk twous CyQuant la. BHI: endèks sante byoenèjetik; SRC: kapasite rezèv respiratwa; OCR: to konsomasyon oksijèn. Done yo prezante kòm mwayèn ± devyasyon estanda (SD), n = 5 eksperyans endepandan. Konparezon estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk ANOVA yon sèl chemen ak tès Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ak ***p < 0.001
Pou nou te ka gen yon pi bon konpreyansyon sou efè IPA sou pwofil byoenèjetik selil LX-2 aktive pa TGF-β1, nou te analize fosforilasyon oksidatif mitokondriyal pa OCR (Fig. 3C,D). Rezilta yo te montre ke tretman TGF-β1 te kapab diminye respirasyon maksimòm, kapasite rezèv respiratwa (SRC) ak BHI konpare ak gwoup kontwòl la (Fig. 3C,D). Anplis de sa, tretman konbinezon an te diminye respirasyon debaz, flit pwoton ak pwodiksyon ATP, men SRC ak BHI te siyifikativman pi wo pase sa yo trete ak TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Nou te fè tou "Tès Fenotip Enèji Selilè" lojisyèl Seahorse la bay (Fig. Siplemantè 4A-D). Jan Fig. Siplemantè 3B montre, tou de potansyèl metabolik OCR ak ECAR yo te diminye apre tretman TGF-β1, sepandan, pa gen okenn diferans ki te obsève nan gwoup tretman konbinezon an ak IPA konpare ak gwoup kontwòl la. Anplis de sa, tou de nivo bazal ak estrès OCR yo te diminye apre tretman konbinezon ak IPA konpare ak gwoup kontwòl la (Fig. Siplemantè 4C). Sa ki enteresan, yon modèl menm jan an te obsève ak terapi konbinezon an, kote pa gen okenn chanjman nan nivo bazal ak estrès ECAR ki te obsève konpare ak tretman TGF-β1 (Fig. Siplemantè 4C). Nan HSC yo, rediksyon nan fosforilasyon oksidatif mitokondriyal ak kapasite tretman konbinezon an pou retabli SCR ak BHI apre ekspozisyon a tretman TGF-β1 pa t chanje potansyèl metabolik la (OCR ak ECAR). Lè nou mete tout rezilta sa yo ansanm, yo endike ke IPA ka diminye byoenèji nan HSC yo, sa ki sijere ke IPA ka pwovoke yon pwofil enèjik ki pi ba ki chanje fenotip HSC a nan direksyon inaktivasyon (Figi Siplemantè 4D).
Yo te envestige efè IPA sou dinamik mitokondriyal la lè l sèvi avèk kantifikasyon twa dimansyon mòfoloji mitokondriyal ak koneksyon rezo ansanm ak koloran MTR (Figi 4 ak Figi Siplemantè 5). Figi 4 montre ke, konpare ak gwoup kontwòl la, tretman TGF-β1 te diminye sifas mwayèn nan, kantite branch, longè total branch, ak kantite jonksyon branch (Figi 4A ak B) epi li te chanje pwopòsyon mitokondri yo soti nan mòfoloji esferik rive nan mòfoloji entèmedyè (Figi 4C). Se sèlman tretman IPA ki te diminye volim mitokondriyal mwayèn nan epi ki te chanje pwopòsyon mitokondri yo soti nan mòfoloji esferik rive nan mòfoloji entèmedyè konpare ak gwoup kontwòl la (Figi 4A). Okontrè, esferisite, longè mwayèn branch, ak aktivite mitokondriyal evalye pa MTR ki depann de potansyèl manbràn mitokondriyal la (Figi 4A ak E) te rete san chanjman epi paramèt sa yo pa t diferan ant gwoup yo. Lè yo pran ansanm, rezilta sa yo sijere ke tretman TGF-β1 ak IPA sanble module fòm ak gwosè mitokondriyal yo ansanm ak konpleksite rezo nan selil LX-2 vivan yo.
IPA modifye dinamik mitokondriyal ak abondans ADN mitokondriyal nan selil LX-2 yo. A. Imaj konfokal reprezantatif selil LX-2 vivan ki enkube ak TGF-β1 (5 ng/ml) ak 1 mM IPA pandan 24 èdtan nan yon mwayen san serom ki montre rezo mitokondriyal ki kolore ak Mitotracker™ Red CMXRos ak nwayo ki kolore an ble ak DAPI. Tout done yo genyen omwen 15 imaj pa gwoup. Nou te akeri 10 imaj Z-stack pou chak kalite echantiyon. Chak sekans Z-aks genyen 30 tranch, chak ak yon epesè 9.86 μm. Ba echèl: 10 μm. B. Objè reprezantatif (mitokondri sèlman) idantifye lè yo aplike papòt adaptatif nan imaj la. Analiz kantitatif ak konparezon koneksyon rezo mòfolojik mitokondriyal yo te fèt pou tout selil nan chak gwoup. C. Frekans rapò fòm mitokondriyal yo. Valè ki pre 0 endike fòm esferik, epi valè ki pre 1 endike fòm filamante. D Kontni ADN mitokondriyal (mtDNA) te detèmine jan sa dekri nan Materyèl ak Metòd. Analiz E Mitotracker™ Red CMXRos la te fèt pa sitometri koule (30,000 evènman) jan sa dekri nan Materyèl ak Metòd yo. Done yo prezante kòm mwayèn ± SD, n = 3 eksperyans endepandan. Konparezon estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk ANOVA yon sèl chemen ak tès Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Apre sa, nou te analize kontni ADNmt nan selil LX-2 yo kòm yon endikatè kantite mitokondri. Konpare ak gwoup kontwòl la, kontni ADNmt la te ogmante nan gwoup trete ak TGF-β1 la (Figi 4D). Konpare ak gwoup trete ak TGF-β1 la, kontni ADNmt la te diminye nan gwoup tretman konbinezon an (Figi 4D), sa ki sijere ke IPA ka diminye kontni ADNmt la e petèt kantite mitokondri a ansanm ak respirasyon mitokondri a (Figi 3C). Anplis, IPA te sanble diminye kontni ADNmt la nan tretman konbinezon an men li pa t afekte aktivite mitokondri ki medyatè pa MTR (Figi 4A-C).
Nou te envestige asosyasyon IPA a ak nivo mRNA jèn ki asosye avèk fibwoz, apoptoz, siviv, ak dinamik mitokondriyal nan selil LX-2 yo (Figi 5A-D). Konpare ak gwoup kontwòl la, gwoup trete ak TGF-β1 la te montre yon ogmantasyon nan ekspresyon jèn tankou chèn α2 kolagen tip I (COL1A2), α-aktin misk lis (αSMA), metaloproteinaz matris 2 (MMP2), inibitè tisi metaloproteinaz 1 (TIMP1), ak jèn ki sanble ak dinamin 1 (DRP1), sa ki endike yon ogmantasyon nan fibwoz ak aktivasyon. Anplis de sa, konpare ak gwoup kontwòl la, tretman TGF-β1 la te redwi nivo mRNA reseptè pregnan X nikleyè (PXR), kaspaz 8 (CASP8), MAPKAPK3, inibitè α selil B, anplifikatè peptid limyè jèn faktè nikleyè κ (NFκB1A), ak inibitè sou-inite kinaz faktè nikleyè κB β (IKBKB) (Figi 5A-D). Konpare ak tretman TGF-β1, tretman konbinezon ak TGF-β1 ak IPA te diminye ekspresyon COL1A2 ak MMP2, men li te ogmante nivo mRNA PXR, TIMP1, lenfom selil B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, ak IKBKB. Tretman IPA a te diminye anpil ekspresyon MMP2, pwoteyin X ki asosye ak Bcl-2 (BAX), AKT1, pwoteyin atrofi optik 1 (OPA1), ak pwoteyin fizyon mitokondriyal 2 (MFN2), alòske ekspresyon CASP8, NFκB1A, NFκB1B, ak IKBKB te ogmante konpare ak gwoup kontwòl la. Sepandan, pa gen okenn diferans ki te jwenn nan ekspresyon caspase-3 (CASP3), faktè aktivasyon peptidaz apoptotik 1 (APAF1), pwoteyin fizyon mitokondriyal 1 (MFN1), ak pwoteyin fizyon 1 (FIS1). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke tretman IPA a module ekspresyon jèn ki asosye avèk fibwoz, apoptoz, siviv, ak dinamik mitokondriyal. Done nou yo sijere ke tretman IPA a diminye fibwoz nan selil LX-2 yo; an menm tan, li estimile siviv lè li chanje fenotip la nan direksyon inaktivasyon.
IPA module ekspresyon jèn fibroblas, apoptotik, viabilité, ak dinamik mitokondriyal nan selil LX-2 yo. Istogram yo montre ekspresyon mRNA an relasyon ak kontwòl andojèn (RPLP0 oswa PPIA) apre selil LX-2 yo te pwovoke ak TGF-β1 ak IPA nan yon mwayen san serom pandan 24 èdtan. A endike fibroblas, B endike selil apoptotik, C endike selil sivivan, epi D endike ekspresyon jèn dinamik mitokondriyal. Done yo prezante kòm mwayèn ± devyasyon estanda (SD), n = 3 eksperyans endepandan. Konparezon estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk ANOVA yon sèl chemen ak tès Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Apre sa, chanjman nan gwosè selil yo (FSC-H) ak konpleksite sitoplasmik (SSC-H) yo te evalye pa sitometri koule (Figi 6A,B), epi chanjman nan mòfoloji selil apre tretman IPA a te evalye pa mikwoskòp elektwonik transmisyon (TEM) ak mikwoskòp kontras faz (Figi Siplemantè 6A-B). Jan yo te espere a, selil yo nan gwoup trete ak TGF-β1 la te ogmante nan gwosè konpare ak gwoup kontwòl la (Figi 6A,B), ki montre ekspansyon klasik retikulum andoplasmik ki graj (ER*) ak fagolizozòm (P), ki endike aktivasyon selil souch ematopoyetik (HSC) (Figi Siplemantè 6A). Sepandan, konpare ak gwoup trete ak TGF-β1 la, gwosè selil la, konpleksite sitoplasmik la (Fig. 6A,B), ak kontni ER* te diminye nan gwoup tretman konbinezon TGF-β1 ak IPA a (Figi Siplemantè 6A). Anplis, tretman IPA a diminye gwosè selil yo, konpleksite sitoplasmik la (Fig. 6A,B), kontni P ak ER* (Fig. Siplemantè 6A) konpare ak gwoup kontwòl la. Anplis de sa, kontni selil apoptotik yo ogmante apre 24 èdtan tretman IPA konpare ak gwoup kontwòl la (flèch blan, Fig. Siplemantè 6B). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke 1 mM IPA ka estimile apoptoz HSC epi ranvèse chanjman nan paramèt mòfolojik selilè ki pwovoke pa TGF-β1, kidonk regle gwosè ak konpleksite selil la, ki ka asosye avèk inaktivasyon HSC.
IPA modifye gwosè selil ak konpleksite sitoplasmik nan selil LX-2 yo. Imaj reprezantatif analiz sitometri koule. Analiz la te itilize yon estrateji gating espesifik pou selil LX-2 yo: SSC-A/FSC-A pou defini popilasyon selilè a, FSC-H/FSC-A pou idantifye doub yo, ak SSC-H/FSC-H pou analiz gwosè ak konpleksite selil yo. Selil yo te enkube ak TGF-β1 (5 ng/ml) ak 1 mM IPA nan yon mwayen san serom pandan 24 èdtan. Selil LX-2 yo te distribye nan kadran anba goch (SSC-H-/FSC-H-), kadran anwo goch (SSC-H+/FSC-H-), kadran anba dwat (SSC-H-/FSC-H+), ak kadran anwo dwat (SSC-H+/FSC-H+) pou analiz gwosè selil ak konpleksite sitoplasmik. B. Yo te analize mòfoloji selilè a pa sitometri koule lè l sèvi avèk FSC-H (dispersyon devan, gwosè selil) ak SSC-H (dispersyon bò, konpleksite sitoplasmik) (30,000 evènman). Done yo prezante kòm mwayèn ± SD, n = 3 eksperyans endepandan. Konparezon estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk ANOVA yon sèl chemen ak tès Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ak ****p < 0.0001
Metabolit entesten tankou IPA vin tounen yon sijè cho nan rechèch, sa ki sijere ke yo ka dekouvri nouvo sib nan mikwobyota entesten an. Se poutèt sa, li enteresan ke IPA, yon metabolit ke nou te lye ak fibwoz fwa nan moun [15], te montre li se yon potansyèl konpoze anti-fibwotik nan modèl bèt [13, 14]. La a, nou demontre pou premye fwa yon asosyasyon ant IPA serik ak transkriptomik fwa global ak metilasyon ADN nan moun obèz san dyabèt tip 2 (T2D), mete aksan sou apoptoz, mitofaji ak lonjevite, osi byen ke yon posib jèn kandida AKT1 ki reglemante omeyostazi fwa. Yon lòt nouvote nan etid nou an se ke nou demontre entèraksyon tretman IPA ak apoptoz, mòfoloji selilè, byoenèji mitokondriyal ak dinamik nan selil LX-2, ki endike yon spectre enèji ki pi ba ki deplase fenotip HSC a nan direksyon inaktivasyon, sa ki fè IPA yon kandida potansyèl pou amelyore fibwoz fwa.
Nou te jwenn ke apoptoz, mitofaji ak lonjevite te chemen kanonik ki pi enpòtan yo ki te rich nan jèn fwa ki asosye avèk IPA ki sikile nan sewòm. Entèripsyon sistèm kontwòl kalite mitokondriyal (MQC) la ka mennen nan disfonksyon mitokondriyal, mitofaji ak apoptoz, kidonk ankouraje ensidans MASLD [33, 34]. Se poutèt sa, nou ka espekile ke IPA ka enplike nan mentni dinamik selilè ak entegrite mitokondriyal atravè apoptoz, mitofaji ak lonjevite nan fwa a. Done nou yo te montre ke de jèn te komen nan twa tès yo: YKT6 ak AKT1. Li enpòtan pou note ke YKT6 se yon pwoteyin SNARE ki enplike nan pwosesis fizyon manbràn selilè. Li jwe yon wòl nan otofaji ak mitofaji lè li fòme yon konplèks inisyasyon ak STX17 ak SNAP29 sou otofagozòm nan, kidonk ankouraje fizyon otofagozòm ak lizozòm [35]. Anplis, pèt fonksyon YKT6 lakòz mitofaji ki gen pwoblèm [36], alòske ogmantasyon YKT6 asosye avèk pwogresyon kansè epatoselilè (HCC), sa ki montre yon ogmantasyon nan siviv selilè [37]. Yon lòt bò, AKT1 se jèn ki pi enpòtan nan entèraksyon an epi li jwe yon wòl enpòtan nan maladi fwa, tankou chemen siyal PI3K/AKT, sik selilè, migrasyon selilè, pwoliferasyon, adezyon fokal, fonksyon mitokondriyal, ak sekresyon kolagen [38-40]. Chemen siyal PI3K/AKT aktive a ka aktive selil souch ematopoyetik (HSC), ki se selil ki responsab pou pwodiksyon matris ekstraselilè (ECM), epi deregleman li ka kontribye nan aparisyon ak pwogresyon fibwoz fwa [40]. Anplis de sa, AKT se youn nan faktè kle siviv selilè ki anpeche apoptoz selilè depandan de p53, epi aktivasyon AKT ka asosye avèk inibisyon apoptoz selil fwa [41, 42]. Rezilta yo jwenn yo sijere ke IPA ka enplike nan apoptoz ki asosye ak mitokondri fwa a lè li afekte desizyon epatosit yo ant antre nan apoptoz oswa siviv. Efè sa yo ka reglemante pa jèn kandida AKT ak/oswa YKT6, ki enpòtan pou omeyostazi fwa a.
Rezilta nou yo montre ke 1 mM IPA pwovoke apoptoz epi diminye respirasyon mitokondriyal nan selil LX-2 yo endepandamman de tretman TGF-β1. Li enpòtan pou note ke apoptoz se yon chemen prensipal pou rezolisyon fibwoz ak aktivasyon selil souch ematopoyetik (HSC), epi li se tou yon evènman kle nan repons fizyolojik revèsib nan fibwoz fwa [4, 43]. Anplis de sa, restorasyon BHI nan selil LX-2 apre tretman konbinezon bay nouvo apèsi sou wòl potansyèl IPA nan règleman byoenèji mitokondriyal yo. Anba kondisyon repo ak inaktif, selil ematopoyetik yo nòmalman itilize fosforilasyon oksidatif mitokondriyal pou pwodui ATP epi yo gen yon aktivite metabolik ki ba. Nan lòt men an, aktivasyon HSC amelyore respirasyon ak byosentèz mitokondriyal pou konpanse pou demand enèji pou antre nan eta glikolitik la [44]. Lefèt ke IPA pa t afekte potansyèl metabolik ak ECAR sijere ke chemen glikolitik la mwens priyorize. Menm jan an tou, yon lòt etid te montre ke 1 mM IPA te kapab modifye aktivite chèn respiratwa mitokondriyal nan kadyomyosit, liy selil epatosit imen (Huh7) ak selil andotelyal venn lonbrit imen (HUVEC); Sepandan, yo pa jwenn okenn efè IPA sou glikoliz nan kadyomyosit, sa ki sijere ke IPA ka afekte byoenèji lòt kalite selil [45]. Se poutèt sa, nou espekile ke 1 mM IPA ka aji kòm yon dekouplè chimik modere, piske li ka siyifikativman diminye ekspresyon jèn fibwojèn, mòfoloji selilè ak byoenèji mitokondriyal san chanje kantite mtDNA [46]. Dekouplè mitokondriyal yo ka anpeche fibwoz pwovoke pa kilti ak aktivasyon HSC [47] epi redwi pwodiksyon ATP mitokondriyal ki reglemante oswa pwovoke pa sèten pwoteyin tankou pwoteyin dekouplè (UCP) oswa translokaz nikleotid adenin (ANT). Tou depan de kalite selil la, fenomèn sa a ka pwoteje selil yo kont apoptoz ak/oswa ankouraje apoptoz [46]. Sepandan, plis etid nesesè pou klarifye wòl IPA kòm yon dekouplè mitokondriyal nan inaktivasyon selil souch ematopoyetik yo.
Apre sa, nou te envestige si chanjman nan respirasyon mitokondriyal yo reflete nan mòfoloji mitokondriyal nan selil LX-2 vivan yo. Sa ki enteresan, tretman TGF-β1 chanje pwopòsyon mitokondriyal la soti nan esferik rive nan entèmedyè, ak yon diminisyon nan branchman mitokondriyal ak yon ogmantasyon nan ekspresyon DRP1, yon faktè kle nan fizyon mitokondriyal [48]. Anplis de sa, fragmentasyon mitokondriyal asosye avèk konpleksite jeneral rezo a, epi tranzisyon soti nan fizyon rive nan fizyon enpòtan pou aktivasyon selil souch ematopoyetik (HSC), alòske inibisyon fizyon mitokondriyal mennen nan apoptoz HSC [49]. Kidonk, rezilta nou yo endike ke tretman TGF-β1 ka pwovoke yon diminisyon nan konpleksite rezo mitokondriyal la ak yon diminisyon nan branchman, ki pi komen nan fizyon mitokondriyal ki asosye avèk selil souch ematopoyetik aktive (HSC). Anplis de sa, done nou yo te montre ke IPA te kapab chanje pwopòsyon mitokondri yo soti nan yon fòm esferik rive nan yon fòm entèmedyè, kidonk diminye ekspresyon OPA1 ak MFN2. Etid yo montre ke diminisyon OPA1 te kapab lakòz yon diminisyon nan potansyèl manbràn mitokondriyal la epi deklanche apoptoz selilè [50]. MFN2 li te ye pou medyatè fizyon mitokondriyal ak apoptoz [51]. Rezilta yo jwenn sijere ke endiksyon selil LX-2 pa TGF-β1 ak/oswa IPA sanble modifye fòm ak gwosè mitokondri yo, osi byen ke eta aktivasyon ak konpleksite rezo a.
Rezilta nou yo endike ke tretman konbinezon TGFβ-1 ak IPA a te kapab diminye paramèt mtDNA ak mòfolojik selil yo lè li regle ekspresyon mRNA jèn fibwoz, apoptoz ak siviv nan selil ki evite apoptoz. Anfèt, IPA te diminye nivo ekspresyon mRNA AKT1 ak jèn fibwoz enpòtan tankou COL1A2 ak MMP2, men li te ogmante nivo ekspresyon CASP8, ki asosye avèk apoptoz. Rezilta nou yo te montre ke apre tretman IPA a, ekspresyon BAX te diminye epi ekspresyon mRNA sou-inite fanmi TIMP1, BCL-2 ak NF-κB te ogmante, sa ki sijere ke IPA te kapab estimile siyal siviv nan selil souch ematopoyetik (HSC) ki evite apoptoz. Molekil sa yo ka aji kòm siyal pro-siviv nan selil souch ematopoyetik aktive, ki ka asosye avèk ogmantasyon ekspresyon pwoteyin anti-apoptotik (tankou Bcl-2), diminisyon ekspresyon BAX pro-apoptotik, ak yon entèraksyon konplèks ant TIMP ak NF-κB [5, 7]. IPA egzèse efè li yo atravè PXR, epi nou te jwenn ke tretman konbinezon ak TGF-β1 ak IPA ogmante nivo ekspresyon mRNA PXR, sa ki endike sipresyon aktivasyon HSC. Siyalizasyon PXR aktive a li te ye pou anpeche aktivasyon HSC ni in vivo ni in vitro [52, 53]. Rezilta nou yo endike ke IPA ka patisipe nan eliminasyon HSC aktive yo lè li pwomouvwa apoptoz, diminye fibwoz ak metabolis mitokondriyal, epi amelyore siyal siviv, ki se pwosesis tipik ki konvèti fenotip HSC aktive a an yon inaktive. Yon lòt eksplikasyon posib pou mekanis potansyèl ak wòl IPA nan apoptoz se ke li elimine mitokondri disfonksyonèl prensipalman atravè mitofaji (chemen intrinsèk) ak chemen siyalizasyon TNF ekstènè (Tablo 1), ki lye dirèkteman ak chemen siyalizasyon siviv NF-κB a (Figi Siplemantè 7). Sa ki enteresan, jèn rich ki gen rapò ak IPA yo kapab pwovoke siyal pro-apoptotik ak pro-siviv nan chemen apoptotik la [54], sa ki sijere ke IPA ka pwovoke chemen apoptotik la oswa siviv lè li kominike avèk jèn sa yo. Sepandan, kijan IPA pwovoke apoptoz oswa siviv pandan aktivasyon HSC ak chemen mekanistik li yo rete enkoni.
IPA se yon metabolit mikwòb ki fòme apati triptofan dyetetik atravè mikwobyota entesten an. Etid yo montre ke li gen pwopriyete anti-enflamatwa, antioksidan, ak epigenetik regilasyon nan anviwònman entesten an.[55] Etid yo montre ke IPA ka modifye fonksyon baryè entesten an epi redwi estrès oksidatif, sa ki ka kontribye nan efè fizyolojik lokal li yo.[56] Anfèt, IPA transpòte nan ògàn sib yo atravè sikilasyon an, e piske IPA pataje yon estrikti metabolit prensipal ki sanble ak triptofan, serotonin, ak dérivés indol, IPA egzèse aksyon metabolik ki lakòz sò metabolik konpetitif.[52] IPA ka fè konpetisyon ak metabolit ki sòti nan triptofan pou sit lyezon sou anzim oswa reseptè, sa ki ka deranje chemen metabolik nòmal yo. Sa a mete aksan sou nesesite pou plis etid sou farmakokinetik ak farmakodinamik li yo pou pi byen konprann fenèt terapetik li.[57] Li rete pou wè si sa ka rive tou nan selil souch ematopoyetik (HSC).
Nou rekonèt ke etid nou an gen kèk limitasyon. Pou nou egzamine espesyalman asosyasyon ki gen rapò ak IPA, nou te eskli pasyan ki gen dyabèt tip 2 (T2DM). Nou rekonèt ke sa limite aplikabilite laj rezilta nou yo pou pasyan ki gen dyabèt tip 2 ak maladi fwa avanse. Malgre ke konsantrasyon fizyolojik IPA nan serom imen an se 1-10 μM [11, 20], nou te chwazi yon konsantrasyon 1 mM IPA ki baze sou pi gwo konsantrasyon ki pa toksik la [15] ak pi gwo pousantaj apoptoz la, san okenn diferans nan pousantaj popilasyon selil nekrotik la. Malgre ke yo te itilize nivo suprafizyolojik IPA nan etid sa a, kounye a pa gen okenn konsansis konsènan dòz efikas IPA a [52]. Malgre ke rezilta nou yo siyifikatif, sò metabolik IPA a an jeneral rete yon domèn rechèch aktif. Anplis, rezilta nou yo sou asosyasyon ki genyen ant nivo IPA nan serom ak metilasyon ADN nan transkripsyon fwa yo te jwenn pa sèlman nan selil souch ematopoyetik (HSC) men tou nan tisi fwa. Nou te chwazi pou nou itilize selil LX-2 imen yo baze sou rezilta nou te jwenn anvan yo nan analiz transkriptòm ki montre ke IPA asosye avèk aktivasyon selil souch ematopoyetik (HSC) [15], epi HSC yo se selil prensipal ki enplike nan pwogresyon fibwoz fwa a. Fwa a konpoze de plizyè kalite selil, kidonk lòt modèl selil tankou sistèm ko-kilti selil iminitè epatosit-HSC konbine avèk aktivasyon kaspaz ak fragmentasyon ADN ansanm ak mekanis aksyon ki gen ladan nivo pwoteyin yo ta dwe konsidere pou etidye wòl IPA ak entèraksyon li ak lòt kalite selil fwa.