Atik la fè pati sijè rechèch "Amelyore rezistans legim yo kont patojèn ak ensèk nuizib", gade tout 5 atik yo
Ajan kozatif maladi nekwoz chanpiyon plant yo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary itilize yon estrateji plizyè nivo pou enfekte diferan plant lame. Etid sa a pwopoze itilizasyon diamin L-ornitin, yon asid amine ki pa pwoteyin ki stimul sentèz lòt asid amine esansyèl, kòm yon estrateji jesyon altènatif pou amelyore repons molekilè, fizyolojik ak byochimik Phaseolus vulgaris L. anvè mwazi blan ki koze pa Pseudomonas sclerotiorum. Eksperyans in vitro yo te montre ke L-ornitin te anpeche kwasans miselyèl S. pyrenoidosa anpil nan yon fason ki depann de dòz la. Anplis de sa, li te kapab diminye gravite mwazi blan an anpil nan kondisyon sèr. Anplis de sa, L-ornitin te stimul kwasans plant trete yo, sa ki endike ke konsantrasyon L-ornitin yo teste yo pa te fitotoksik pou plant trete yo. Anplis de sa, L-ornitin te amelyore ekspresyon antioksidan ki pa anzimatik yo (fenolik ak flavonoid total idrosolubl) ak antioksidan anzimatik yo (katalaz (CAT), peroksidaz (POX), ak polifenol oksidaz (PPO)), epi li te ogmante ekspresyon twa jèn ki gen rapò ak antioksidan (PvCAT1, PvSOD, ak PvGR). Anplis de sa, analiz in silico te revele prezans yon swadizan pwoteyin oksaloacetat asetilidwolaz (SsOAH) nan jenòm S. sclerotiorum nan, ki te trè menm jan ak pwoteyin oksaloacetat asetilidwolaz (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) ak Penicillium sp. (PlOAH) an tèm de analiz fonksyonèl, domèn konsève, ak topoloji. Sa ki enteresan, adisyon L-ornitin nan mwayen bouyon dekstròz pòmdetè (PDB) te diminye anpil ekspresyon jèn SsOAH nan miseli S. sclerotiorum. Menm jan an tou, aplikasyon ekzojèn L-ornitin lan te diminye anpil ekspresyon jèn SsOAH la nan miseliya chanpiyon yo kolekte nan plant trete yo. Finalman, aplikasyon L-ornitin lan te diminye anpil sekresyon asid oksalik nan tou de milye PDB a ak fèy enfekte yo. An konklizyon, L-ornitin jwe yon wòl kle nan kenbe estati redoks la epi tou nan amelyore repons defans plant enfekte yo. Rezilta etid sa a ka ede nan devlope metòd inovatè ak respekte anviwònman an pou kontwole mwazi blan an epi diminye enpak li sou pwodiksyon pwa ak lòt rekòt yo.
Mwazi blan, ki koze pa chanpiyon nekrotwofik Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary a, se yon maladi devastatè ki diminye sede epi ki poze yon menas grav pou pwodiksyon pwa mondyal (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum se youn nan patojèn plant ki transmèt nan tè ki pi difisil pou kontwole, ak yon pakèt lame ki gen plis pase 600 espès plant ak kapasite pou masere tisi lame yo rapidman nan yon fason ki pa espesifik (Liang ak Rollins, 2018). Anba kondisyon defavorab, li sibi yon faz kritik nan sik lavi li, li rete andòmi pandan yon bon bout tan kòm estrikti nwa, di, ki sanble ak grenn yo rele 'skleroti' nan tè a oswa kòm kwasans blan, an gonfle nan miselyòm oswa nan mitan tij plant ki enfekte yo (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum kapab fòme skleroti, sa ki pèmèt li siviv nan jaden enfekte pandan yon bon bout tan epi pèsiste pandan maladi a (Schwartz et al., 2005). Skleroti yo rich an eleman nitritif, yo ka pèsiste nan tè a pandan yon bon bout tan, epi yo sèvi kòm inokulum prensipal pou enfeksyon ki vin apre yo (Schwartz et al., 2005). Nan kondisyon favorab, skleroti yo jèmen epi pwodui espò ki nan lè a ki ka enfekte tout pati plant lan ki anlè tè a, tankou flè, tij, oswa gous (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum itilize yon estrateji plizyè nivo pou enfekte plant lame li yo, ki enplike yon seri evènman kowòdone soti nan jèminasyon sklerosyal rive nan devlopman sentòm yo. Okòmansman, S. sclerotiorum pwodui espò sispann (yo rele askospò) nan estrikti ki sanble ak djondjon yo rele apotesi, ki vin nan lè a epi devlope an sklerosyal ki pa mobil sou debri plant enfekte yo (Bolton et al., 2006). Apre sa, chanpiyon an sekrete asid oksalik, yon faktè virulans, pou kontwole pH miray selil plant lan, ankouraje degradasyon anzimatik ak envazyon tisi (Hegedus ak Rimmer, 2005), epi siprime eksplozyon oksidatif plant lame a. Pwosesis asidifikasyon sa a febli miray selil plant lan, bay yon anviwònman favorab pou fonksyònman nòmal ak efikas anzim ki degrade miray selil chanpiyon an (CWDE), sa ki pèmèt patojèn nan simonte baryè fizik la epi penetre tisi lame yo (Marciano et al., 1983). Yon fwa li penetre, S. sclerotiorum sekrete yon kantite CWDE, tankou poligalacturonaz ak selulaz, ki fasilite diseminasyon li nan tisi enfekte yo epi lakòz nekwoz tisi. Pwogresyon lezyon yo ak tapi ifal yo mennen nan sentòm karakteristik mwazi blan an (Hegedus ak Rimmer, 2005). Pandansetan, plant lame yo rekonèt modèl molekilè ki asosye ak patojèn (PAMP) atravè reseptè rekonesans modèl (PRR), sa ki deklanche yon seri evènman siyal ki finalman aktive repons defans yo.
Malgre plizyè dizèn ane efò pou kontwole maladi yo, toujou gen mank jèmoplasm rezistan ki nesesè nan pwa, menm jan ak nan lòt rekòt komèsyal yo, akòz rezistans, siviv, ak adaptabilite patojèn nan. Se poutèt sa, jesyon maladi a trè difisil epi li mande yon estrateji entegre ak milti-fasèt ki gen ladan yon konbinezon pratik kiltirèl, kontwòl byolojik, ak fonjisid chimik (O'Sullivan et al., 2021). Kontwòl chimik mwazi blan an se pi efikas paske fonjisid yo, lè yo aplike kòrèkteman e nan bon moman, ka kontwole efektivman pwopagasyon maladi a, diminye gravite enfeksyon an, epi minimize pèt sede. Sepandan, twòp itilizasyon ak twòp depandans sou fonjisid ka mennen nan aparisyon souch rezistan S. sclerotiorum epi gen yon enpak negatif sou òganis ki pa sib yo, sante tè a, ak kalite dlo a (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Se poutèt sa, jwenn altènativ ki respekte anviwònman an vin tounen yon pi gwo priyorite.
Poliamin (PA), tankou putrescine, spermidine, spermine, ak cadaverine, kapab sèvi kòm altènativ pwomèt kont patojèn plant ki soti nan tè a, kidonk diminye nèt oswa pasyèlman itilizasyon fonjisid chimik danjere (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Nan plant siperyè yo, PA yo enplike nan anpil pwosesis fizyolojik tankou, men pa limite a, divizyon selilè, diferansyasyon, ak repons a estrès abyotik ak byotik (Killiny ak Nehela, 2020). Yo ka aji kòm antioksidan, ede elimine espès oksijèn reyaktif (ROS), kenbe omeyostazi redoks (Nehela ak Killiny, 2023), pwovoke jèn ki gen rapò ak defans (Romero et al., 2018), kontwole divès chemen metabolik (Nehela ak Killiny, 2023), modifye fitoòmòn andojèn (Nehela ak Killiny, 2019), etabli rezistans sistemik akeri (SAR), epi kontwole entèraksyon plant-patojèn (Nehela ak Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Li enpòtan pou note ke mekanis espesifik ak wòl PA yo nan defans plant yo varye selon espès plant yo, patojèn yo, ak kondisyon anviwònman yo. PA ki pi abondan nan plant yo byosentetize apati poliamin esansyèl L-ornitin (Killiny ak Nehela, 2020).
L-ornitin jwe plizyè wòl nan kwasans ak devlopman plant yo. Pa egzanp, etid anvan yo te montre ke nan diri (Oryza sativa), ornitin ka asosye avèk resiklaj azòt (Liu et al., 2018), sede, kalite ak bon sant diri (Lu et al., 2020), ak repons estrès idrik (Yang et al., 2000). Anplis de sa, aplikasyon ekzojèn L-ornitin te amelyore anpil tolerans sechrès nan bètrav sik (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) epi li te soulaje estrès sèl nan plant zonyon (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ak Çavuşoǧlu, 2021) ak kajou (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Wòl potansyèl L-ornitin nan defans kont estrès abyotik la ka akòz patisipasyon li nan akimilasyon prolin nan plant trete yo. Pa egzanp, yo te deja rapòte ke jèn ki gen rapò ak metabolis prolin, tankou ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) ak jèn prolin dezidrogenase (ProDH1 ak ProDH2), te enplike nan defans Nicotiana benthamiana ak Arabidopsis thaliana kont souch Pseudomonas syringae ki pa lame (Senthil-Kumar ak Mysore, 2012). Yon lòt bò, ornithine decarboxylase (ODC) fonjik la nesesè pou kwasans patojèn (Singh et al., 2020). Vize ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici atravè silansman jèn pwovoke pa lame a (HIGS) te amelyore anpil rezistans plant tomat yo kont flétrissement Fusarium (Singh et al., 2020). Sepandan, yo pa ko byen etidye wòl potansyèl aplikasyon ornithine ekzojèn kont estrès byotik tankou fitopatojèn. Pi enpòtan, efè ornitin sou rezistans maladi ak fenomèn byochimik ak fizyolojik ki asosye avèk yo rete lajman enkonu.
Konprann konpleksite enfeksyon S. sclerotiorum nan legim yo enpòtan pou devlopman estrateji kontwòl efikas. Nan etid sa a, nou te vize idantifye wòl potansyèl diamin L-ornitin kòm yon faktè kle nan amelyore mekanis defans ak rezistans plant legim yo kont enfeksyon Sclerotinia sclerotiorum. Nou fè ipotèz ke, anplis amelyorasyon repons defans plant enfekte yo, L-ornitin jwe tou yon wòl kle nan mentni estati redoks la. Nou pwopoze ke efè potansyèl L-ornitin yo gen rapò ak règleman mekanis defans antioksidan anzimatik ak non-anzimatik ak entèferans ak faktè patojenik/virulans chanpiyon ak pwoteyin ki asosye yo. Fonksyonalite doub L-ornitin sa a fè li yon kandida pwomèt pou yon estrateji dirab pou diminye enpak mwazi blan an epi amelyore rezistans rekòt legim komen yo kont patojèn chanpiyon pisan sa a. Rezilta etid sa a ka ede nan devlopman metòd inovatè, ki respekte anviwònman an pou kontwole mwazi blan an epi diminye enpak li sou pwodiksyon legim.
Nan etid sa a, yo te itilize yon varyete komèsyal pwa komen ki sansib, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), kòm materyèl eksperimantal. Depatman Rechèch sou Legume, Enstiti Rechèch sou Rekòt nan Jaden (FCRI), Sant Rechèch Agrikòl (ARC), peyi Lejip te bay grenn ki an sante. Yo te simen senk grenn nan po plastik (dyamèt enteryè 35 cm, pwofondè 50 cm) plen ak tè ki enfekte ak S. sclerotiorum anba kondisyon sèr (25 ± 2 °C, imidite relatif 75 ± 1%, 8 èdtan limyè/16 èdtan fènwa). 7-10 jou apre simen (DPS), yo te eklèsi plant yo pou kite sèlman de plant ak kwasans inifòm ak twa fèy konplètman elaji nan chak po. Yo te wouze tout plant ki nan po yo yon fwa chak de semèn epi yo te fètilize yo chak mwa nan to rekòmande pou varyete a.
Pou prepare yon konsantrasyon 500 mg/L L-ornithinediamine (ke yo rele tou (+)-(S)-2,5-diaminopentanoik asid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almay), yo te premye fonn 50 mg nan 100 mL dlo distile esteril. Apre sa, yo te delye solisyon stock la epi yo te itilize li nan eksperyans ki vin apre yo. An brèf, yo te teste sis seri konsantrasyon L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, ak 125 mg/L) in vitro. Anplis de sa, yo te itilize dlo distile esteril kòm yon kontwòl negatif (Mock) epi yo te itilize fonjisid komèsyal "Rizolex-T" 50% poud mouyab (toclofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, peyi Lejip) kòm yon kontwòl pozitif. Yo te teste fonjisid komèsyal "Rizolex-T" la in vitro nan senk konsantrasyon (2, 4, 6, 8 ak 10 mg/L).
Yo te kolekte echantiyon tij ak gous pwa komen ki montre sentòm tipik mwazi blan (to enfestasyon: 10–30%) nan fèm komèsyal yo. Malgre ke yo te idantifye pifò nan materyèl plant enfekte yo pa espès/varyete (varyete komèsyal ki sansib Giza 3), gen lòt, espesyalman sa yo te jwenn nan mache lokal yo, ki te soti nan espès enkoni. Materyèl enfekte yo te kolekte yo te premye dezenfekte sifas ak yon solisyon ipoklorit sodyòm 0.5% pandan 3 minit, answit rense plizyè fwa ak dlo distile esteril epi siye ak papye filtè esteril pou retire dlo anplis. Apre sa, yo te koupe ògàn enfekte yo an ti moso nan tisi mitan an (ant tisi ki an sante ak tisi ki enfekte yo), kiltive yo sou mwayen agar dekstròz pòmdetè (PDA) epi enkube yo a 25 ± 2 °C ak yon sik 12 èdtan limyè/12 èdtan fènwa pandan 5 jou pou estimile fòmasyon skleroti. Yo te itilize metòd pwent miselyal la tou pou pirifye izolat chanpiyon ki soti nan kilti melanje oswa kontamine. Yo te premye idantifye izolat chanpiyon pirifye a ki baze sou karakteristik mòfolojik kiltirèl li yo epi answit yo te konfime li se S. sclerotiorum ki baze sou karakteristik mikwoskopik. Finalman, tout izolat pirifye yo te teste pou patojenikite sou kiltivatè pwa komen Giza 3 ki sansib a pou satisfè postula Koch yo.
Anplis de sa, izolat S. sclerotiorum ki pi anvayisan an (izolat #3) te konfime plis toujou baze sou sekans entèn espasè transkri (ITS) jan White et al. dekri sa, 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. An brèf, izolat yo te kiltive nan bouyon dekstròz pòmdetè (PDB) epi yo te enkube yo a 25 ± 2 °C pandan 5-7 jou. Apre sa, yo te kolekte miselyòm fongis la, yo te filtre l nan yon twal fwomaj, yo te lave l de fwa avèk dlo esteril, epi yo te seche l avèk papye filtè esteril. ADN jenomik la te izole lè l sèvi avèk Kit Miniprep Fongis/Bakteri Quick-DNA™ (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Apre sa, yo te anplifye rejyon ADNr ITS la lè l sèvi avèk pè primè espesifik ITS1/ITS4 la (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; gwosè espere: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Yo te soumèt pwodui PCR pirifye yo pou sekansaj (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Yo te sekansye sekans ADNr ITS yo bidireksyonèlman lè l sèvi avèk metòd sekansaj Sanger la. Apre sa, yo te konpare sekans rechèch yo ki te rasanble yo ak dènye done ki nan GenBank ak Sant Nasyonal pou Enfòmasyon sou Byoteknoloji (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) lè l sèvi avèk lojisyèl BLASTn. Yo te konpare sekans rechèch la ak 20 lòt souch/izola S. sclerotiorum ki te rekipere nan dènye done ki nan NCBI GenBank (Tablo Siplemantè S1) lè l sèvi avèk ClustalW nan Pake Analiz Jenetik Evolisyonè Molekilè (MEGA-11; vèsyon 11) (Kumar et al., 2024). Yo te fè analiz evolisyonè a lè l sèvi avèk metòd maksimòm pwobabilite a ak modèl sibstitisyon nikleotid jeneral ki ka revèsib nan tan (Nei ak Kumar, 2000). Yo montre pyebwa ki gen pi gwo log-pwobabilite a. Yo chwazi pyebwa inisyal pou rechèch ewristik la lè yo chwazi pyebwa ki gen pi gwo log-pwobabilite ant pyebwa neighbor-joining (NJ) la (Kumar et al., 2024) ak pyebwa maksimòm parsimoni (MP). Yo te konstwi pyebwa NJ a lè l sèvi avèk yon matris distans pè ki kalkile lè l sèvi avèk modèl jeneral ki ka revèsib nan tan (Nei ak Kumar, 2000).
Yo te detèmine aktivite anti-bakteri L-ornitin lan ak bakterisid "Rizolex-T" la in vitro pa metòd difizyon agar la. Metòd: Pran kantite apwopriye nan solisyon stock L-ornitin lan (500 mg/L) epi melanje l byen avèk 10 ml nan medyòm eleman nitritif PDA a pou prepare solisyon ak konsantrasyon final 12.5, 25, 50, 75, 100 ak 125 mg/L, respektivman. Yo te itilize senk konsantrasyon fonjisid "Rizolex-T" la (2, 4, 6, 8 ak 10 mg/L) ak dlo distile esteril kòm yon kontwòl. Apre medyòm lan te fin solidifye, yo te transfere yon bouchon miselyòm ki fèk prepare nan kilti Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm an dyamèt, nan sant bwat Petri a epi yo te kiltive l a 25±2°C jiskaske miselyòm lan te kouvri tout bwat Petri kontwòl la, apre sa yo te anrejistre kwasans chanpiyon an. Kalkile pousantaj anpèchman kwasans radyal S. sclerotiorum lan lè l sèvi avèk ekwasyon 1:
Yo te repete eksperyans lan de fwa, avèk sis replikasyon byolojik pou chak gwoup kontwòl/eksperimantal ak senk po (de plant pa po) pou chak replikasyon byolojik. Yo te analize chak replikasyon byolojik de fwa (de replikasyon teknik) pou asire presizyon, fyab ak repwodiktibilite rezilta eksperimantal yo. Anplis de sa, yo te itilize analiz regresyon probit pou kalkile konsantrasyon inibitwa mwatye maksimòm lan (IC50) ak IC99 (Prentice, 1976).
Pou evalye potansyèl L-ornitin nan kondisyon sèr, yo te fè de eksperyans an po youn apre lòt. An brèf, yo te plen po yo ak tè ajil-sab esterilize (3:1) epi yo te inokile yo ak yon kilti S. sclerotiorum ki fèk prepare. Premyèman, yo te kiltive izolat S. sclerotiorum ki pi anvayisan an (izolat #3) lè yo te koupe yon sklerotyòm an de, yo te mete l fas anba sou yon PDA epi yo te enkube l a 25°C nan fènwa konstan (24 èdtan) pandan 4 jou pou ankouraje kwasans miselyèl la. Apre sa, yo te pran kat bouchon agar 5 mm dyamèt nan kwen ki devan an epi yo te inokile yo ak 100 g yon melanj esteril ble ak son diri (1:1, v/v) epi yo te enkube tout flakon yo a 25 ± 2 °C anba yon sik 12 èdtan limyè/12 èdtan fènwa pandan 5 jou pou ankouraje fòmasyon sklerotyòm. Yo te byen melanje kontni tout flakon yo pou asire omojènite anvan yo te ajoute tè a. Apre sa, yo te ajoute 100 g nan melanj bran kolonizatè a nan chak po pou asire yon konsantrasyon konstan patojèn. Yo te wouze po ki te inokile yo pou aktive kwasans chanpiyon an epi yo te mete yo nan kondisyon sèr pandan 7 jou.
Apre sa, yo te simen senk grenn varyete Giza 3 nan chak po. Pou po ki te trete ak L-ornitin ak fonjisid Rizolex-T a, yo te premye tranpe grenn esterilize yo pandan de zèdtan nan yon solisyon akeuz de konpoze yo ak yon konsantrasyon IC99 final apeprè 250 mg/L ak 50 mg/L respektivman, epi answit yo te seche nan lè a pandan inèdtan anvan yo te simen. Nan lòt men an, yo te tranpe grenn yo nan dlo distile esteril kòm yon kontwòl negatif. Apre 10 jou, anvan premye awozaj la, yo te retire plant yo nan yon ti moso, sa ki te kite sèlman de plant pwòp nan chak po. Anplis de sa, pou asire enfeksyon ak S. sclerotiorum, yo te koupe tij plant pwa ki nan menm etap devlopman an (10 jou) nan de kote diferan lè l sèvi avèk yon bistouri esterilize epi yo te mete apeprè 0.5 g nan melanj bran kolonizatè a nan chak blesi, epi apre sa, yo te mete yon gwo imidite pou ankouraje enfeksyon ak devlopman maladi nan tout plant yo te inokile yo. Yo te blese plant kontwòl yo menm jan an tou, epi yo te mete yon kantite egal (0.5 g) melanj bran esteril, san kolonizasyon, nan blesi a epi yo te kenbe l anba yon imidite ki wo pou simile anviwònman an pou devlopman maladi a epi asire konsistans ant gwoup tretman yo.
Metòd tretman: Plant pwa yo te wouze ak 500 ml yon solisyon akeuz L-ornitin (250 mg/l) oswa fonjisid Rizolex-T (50 mg/l) lè yo te irige tè a, answit tretman an te repete twa fwa nan yon entèval 10 jou. Kontwòl ki te trete ak plasebo a te irige ak 500 ml dlo distile esteril. Tout tretman yo te fèt nan kondisyon sèr (25 ± 2°C, 75 ± 1% imidite relatif, ak yon fotoperyòd 8 èdtan limyè/16 èdtan fènwa). Tout po yo te wouze chak de semèn epi trete chak mwa ak yon angrè NPK balanse (20-20-20, ak 3.6% souf ak mikroeleman TE; Zain Seeds, peyi Lejip) nan yon konsantrasyon 3-4 g/l pa flite fèy dapre rekòmandasyon pou varyete espesifik la ak enstriksyon manifakti a. Sof si yo endike otreman, fèy ki byen elaji (2yèm ak 3yèm fèy apati anwo) yo te kolekte nan chak replikasyon byolojik 72 èdtan apre tretman an (hpt), yo te omojeneize, yo te rasanble epi yo te estoke nan -80 °C pou plis analiz, tankou lokalizasyon istochimik in situ endikatè estrès oksidatif, peroksidasyon lipid, antioksidan anzimatik ak non-anzimatik ak ekspresyon jèn.
Yo te evalye entansite enfeksyon mwazi blan an chak semèn 21 jou apre inokilasyon an (dpi) lè l sèvi avèk yon echèl 1-9 (Tablo Siplemantè S2) ki baze sou echèl Petzoldt ak Dickson (1996) modifye pa Teran et al. (2006). An brèf, yo te egzamine tij ak branch plant pwa yo apati pwen inokilasyon an pou swiv pwogresyon lezyon yo sou entènòd yo ak ne yo. Apre sa, yo te mezire distans lezyon an soti nan pwen inokilasyon an rive nan pwen ki pi lwen sou tij la oswa branch lan epi yo te bay yon nòt 1-9 ki baze sou kote lezyon an ye a, kote (1) te endike pa gen okenn enfeksyon vizib toupre pwen inokilasyon an epi (2-9) te endike yon ogmantasyon gradyèl nan gwosè lezyon an ak pwogresyon sou ne/entènòd yo (Tablo Siplemantè S2). Apre sa, yo te konvèti entansite enfeksyon mwazi blan an an pousantaj lè l sèvi avèk fòmil 2:
Anplis de sa, yo te kalkile sifas ki anba koub pwogresyon maladi a (AUDPC) lè l sèvi avèk fòmil la (Shaner ak Finney, 1977), ki te adapte dènyèman pou pouri blan pwa komen (Chauhan et al., 2020) lè l sèvi avèk ekwasyon 3:
Kote Yi = gravite maladi a nan moman ti, Yi+1 = gravite maladi a nan pwochen moman ti+1, ti = lè premye mezi a (an jou), ti+1 = lè pwochen mezi a (an jou), n = kantite total pwen tan oswa pwen obsèvasyon. Paramèt kwasans plant pwa yo, ki gen ladan wotè plant lan (cm), kantite branch pa plant, ak kantite fèy pa plant, te anrejistre chak semèn pandan 21 jou nan tout replikasyon byolojik yo.
Nan chak replikasyon byolojik, echantiyon fèy (dezyèm ak twazyèm fèy ki byen devlope apati tèt la) te kolekte nan 45yèm jou apre tretman an (15 jou apre dènye tretman an). Chak replikasyon byolojik te konpoze de senk po (de plant pa po). Apeprè 500 mg nan tisi kraze a te itilize pou ekstraksyon pigman fotosentetik yo (klowofil a, klowofil b ak karotenoid) lè l sèvi avèk 80% asetòn a 4 °C nan fènwa. Apre 24 èdtan, echantiyon yo te santrifije epi yo te kolekte sipènatan an pou detèminasyon kontni klowofil a, klowofil b ak karotenoid yo kolorimetrikman lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) dapre metòd (Lichtenthaler, 1987) lè yo mezire absòbans lan nan twa longèdonn diferan (A470, A646 ak A663 nm). Finalman, kontni pigman fotosentetik yo te kalkile lè l sèvi avèk fòmil 4-6 sa yo ki dekri pa Lichtenthaler (1987).
Nan 72 èdtan apre tretman an (hpt), fèy yo (dezyèm ak twazyèm fèy ki byen devlope apati tèt la) te kolekte nan chak replik byolojik pou lokalizasyon istochimik in situ nan oksijene idwojèn (H2O2) ak anyon siperoksid (O2•−). Chak replik byolojik te konsiste de senk po (de plant pa po). Chak replik byolojik te analize an doub (de replik teknik) pou asire presizyon, fyab ak repwodiktibilite metòd la. H2O2 ak O2•− te detèmine lè l sèvi avèk 0.1% 3,3′-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almay) oswa nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almay), respektivman, swivan metòd yo dekri pa Romero-Puertas et al. (2004) ak Adam et al. (1989) ak modifikasyon minè. Pou lokalizasyon istochimik H2O2 in situ, feyè yo te enfiltre nan vakyòm ak 0.1% DAB nan 10 mM Tris tampon (pH 7.8) epi answit enkube nan tanperati chanm nan limyè pandan 60 minit. Feyè yo te blanchi nan 0.15% (v/v) TCA nan 4:1 (v/v) etanòl:klorofòm (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, peyi Lejip) epi answit ekspoze nan limyè jiskaske yo te vin pi fonse. Menm jan an tou, valv yo te enfiltre nan vakyòm ak 10 mM potasyòm fosfat tampon (pH 7.8) ki gen 0.1 w/v % HBT pou lokalizasyon istochimik O2•− in situ. Feyè yo te enkube nan limyè nan tanperati chanm pandan 20 minit, answit blanchi jan sa endike anwo a, epi answit eklere jiskaske tach ble fonse/vyolèt parèt. Yo te evalye entansite koulè mawon an (kòm yon endikatè H2O2) oubyen koulè ble-vyolèt la (kòm yon endikatè O2•−) lè l sèvi avèk vèsyon Fiji nan lojisyèl tretman imaj ImageJ la (http://fiji.sc; aksè 7 mas 2024).
Yo te detèmine malondialdeyid (MDA; kòm yon makè peroksidasyon lipid) dapre metòd Du ak Bramlage (1992) avèk ti modifikasyon. Yo te kolekte fèy ki soti nan chak replikasyon byolojik (dezyèm ak twazyèm fèy ki byen devlope apati tèt la) 72 èdtan apre tretman an (hpt). Chak replikasyon byolojik te gen ladan senk po (de plant pa po). Yo te analize chak replikasyon byolojik an doub (de replikasyon teknik) pou asire presizyon, fyab ak repwodiktibilite metòd la. An brèf, yo te itilize 0.5 g tisi fèy moulu pou ekstraksyon MDA avèk 20% asid trikloroacetic (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) ki gen 0.01% butil idroksitoluèn (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Apre sa, yo te detèmine kontni MDA nan sipènatant la kolorimetrikman lè yo te mezire absòbans lan nan 532 ak 600 nm lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) epi answit yo te eksprime li kòm nmol g−1 FW.
Pou evalyasyon antioksidan ki pa gen anzim ak antioksidan ki gen anzim, yo te kolekte fèy (dezyèm ak twazyèm fèy ki byen devlope apati tèt) nan chak replikasyon byolojik 72 èdtan apre tretman an (hpt). Chak replikasyon byolojik te gen senk po (de plant pa po). Yo te analize chak echantiyon byolojik an doub (de echantiyon teknik). Yo te moulen de fèy ak nitwojèn likid epi yo te itilize yo dirèkteman pou detèminasyon antioksidan ki gen anzim ak ki pa gen anzim, asid amine total, kontni prolin, ekspresyon jèn, ak kantifikasyon oksalat.
Yo te detèmine fenòl total idrosolubl yo lè l sèvi avèk reyaktif Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) avèk ti modifikasyon nan metòd Kahkonen et al. (1999) dekri a. An brèf, yo te ekstrè apeprè 0.1 g tisi fèy omojeneize avèk 20 ml metanòl 80% nan fènwa pandan 24 èdtan epi yo te kolekte sipènatan an apre santrifijasyon. Yo te melanje 0.1 ml ekstrè echantiyon an avèk 0.5 ml reyaktif Folin-Ciocalteu (10%), yo te souke l pandan 30 segonn epi yo te kite l nan fènwa pandan 5 minit. Apre sa, yo te ajoute 0.5 ml solisyon kabonat sodyòm 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) nan chak tib, yo te byen melanje l epi yo te enkube l nan tanperati chanm nan fènwa pandan 1 èdtan. Apre enkubasyon an, yo te mezire absòbans melanj reyaksyon an nan 765 nm lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). Yo te detèmine konsantrasyon total fenòl idrosolubl nan ekstrè echantiyon yo lè l sèvi avèk yon koub kalibrasyon asid galik (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) epi yo te eksprime li kòm miligram ekivalan asid galik pou chak gram pwa fre (mg GAE g-1 pwa fre).
Yo te detèmine kontni total flavonoid idrosolubl la dapre metòd Djeridane et al. (2006) avèk ti modifikasyon. An brèf, yo te melanje 0.3 ml nan ekstrè metanòl ki anwo a avèk 0.3 ml solisyon klori aliminyòm 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), yo te brase byen fò epi answit yo te enkube l nan tanperati chanm pandan 5 minit, apre sa yo te ajoute 0.3 ml solisyon asetat potasyòm 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), yo te byen melanje epi yo te enkube l nan tanperati chanm pandan 30 minit nan fènwa. Apre enkubasyon an, yo te mezire absòbans melanj reyaksyon an nan 430 nm lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). Yo te detèmine konsantrasyon total flavonoid idrosolubl nan ekstrè echantiyon yo lè l sèvi avèk yon koub kalibrasyon rutin (TCI America, Portland, OR, USA) epi answit yo te eksprime l kòm miligram ekivalan rutin pou chak gram pwa fre (mg RE g-1 pwa fre).
Yo te detèmine kontni total asid amine lib nan fèy pwa yo lè l sèvi avèk yon reyaktif ninidrin modifye (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ki baze sou metòd Yokoyama ak Hiramatsu (2003) te pwopoze a epi Sun et al. (2006) te modifye a. An brèf, yo te ekstrè 0.1 g tisi moulu ak yon tanpon pH 5.4, epi yo te fè 200 μL nan sipènatant lan reyaji avèk 200 μL ninidrin (2%) ak 200 μL piridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), yo te enkube l nan yon beny dlo bouyi pandan 30 minit, answit yo te refwadi l epi mezire l nan 580 nm lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). Nan lòt men an, yo te detèmine prolin nan avèk metòd Bates la (Bates et al., 1973). Yo te ekstrè prolin nan avèk 3% asid silfosalisilik (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) epi apre santrifijasyon, yo te melanje 0.5 ml nan sipènatant la avèk 1 ml asid asetik glasyal (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ak reyaktif ninidrin, yo te enkube l nan 90°C pandan 45 minit, yo te refwadi l epi mezire l nan 520 nm lè l sèvi avèk menm espektrofotomèt ki anwo a. Yo te detèmine total asid amine lib yo ak prolin nan ekstrè fèy yo lè l sèvi avèk koub kalibrasyon glisin ak prolin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), respektivman, epi yo te eksprime yo kòm mg/g pwa fre.
Pou detèmine aktivite anzimatik anzim antioksidan yo, yo te ekstrè apeprè 500 mg tisi omojeneize avèk 3 ml 50 mM Tris tampon (pH 7.8) ki gen 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ak 7.5% polivinilpirolidòn (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), yo te santrifije yo a 10,000 × g pandan 20 minit anba frijidè (4 °C), epi yo te kolekte sipènatant la (ekstrè anzim brit) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Apre sa, yo te fè katalaz (CAT) reyaji avèk 2 ml 0.1 M tanpon fosfat sodyòm (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ak 100 μl solisyon 269 mM H2O2 pou detèmine aktivite anzimatik li dapre metòd Aebi (1984) avèk ti modifikasyon (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Yo te detèmine aktivite anzimatik peroksidaz depandan guaiacol (POX) la lè l sèvi avèk metòd Harrach et al. (2009). (2008) avèk ti modifikasyon (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) epi aktivite anzimatik polifenol oksidaz (PPO) te detèmine apre reyaksyon avèk 2.2 ml 100 mM tanpon fosfat sodyòm (pH 6.0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) ak 100 μl 12 mM H2O2. Metòd la te yon ti jan modifye apati (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Tès la te fèt apre reyaksyon avèk 3 ml solisyon katechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) ki fèk prepare nan 0.1 M tanpon fosfat (pH 6.0). Yo te mezire aktivite CAT la lè yo te siveye dekonpozisyon H2O2 a 240 nm (A240), yo te mezire aktivite POX la lè yo te siveye ogmantasyon absòbans lan a 436 nm (A436), epi yo te mezire aktivite PPO a lè yo te anrejistre fluktuasyon absòbans yo a 495 nm (A495) chak 30 s pandan 3 min lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV-160A (Shimadzu, Japon).
Yo te itilize RT-PCR an tan reyèl pou detekte nivo transkripsyon twa jèn ki gen rapò ak antioksidan, tankou katalaz peroksizomal (PvCAT1; Nimewo Aksè GenBank KF033307.1), siperoksid dismitaz (PvSOD; Nimewo Aksè GenBank XM_068639556.1), ak glutatyon reduktaz (PvGR; Nimewo Aksè GenBank KY195009.1), nan fèy pwa (dezyèm ak twazyèm fèy ki byen devlope yo apati tèt la) 72 èdtan apre dènye tretman an. An brèf, yo te izole ARN lè l sèvi avèk Simply P Total RNA Extraction Kit (Nimewo Katalòg BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Lachin) dapre pwotokòl manifakti a. Apre sa, yo te sentetize ADNc lè l sèvi avèk TOP script™ cDNA Synthesis Kit dapre enstriksyon manifakti a. Sekans primè twa jèn ki anwo yo nan Tablo Siplemantè S3. Yo te itilize PvActin-3 (nimewo aksè GenBank: XM_068616709.1) kòm jèn entèn epi yo te kalkile ekspresyon relatif jèn nan lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCT la (Livak ak Schmittgen, 2001). Yo te demontre estabilite aktin anba estrès byotik (entèraksyon enkonpatib ant legim komen ak chanpiyon antraknoz Colletotrichum lindemuthianum) ak estrès abyotik (sechrès, salinite, tanperati ki ba) (Borges et al., 2012).
Okòmansman, nou te fè yon analiz in silico sou tout jenòm pwoteyin oksaloacetat asetilidwolaz (OAH) nan S. sclerotiorum lè l sèvi avèk zouti pwoteyin-pwoteyin BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). An brèf, nou te itilize OAH ki soti nan Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksid: 1191702; nimewo aksè GenBank XP_040799428.1; 342 asid amine) ak Penicillium lagena (PlOAH; taksid: 94218; nimewo aksè GenBank XP_056833920.1; 316 asid amine) kòm sekans rechèch pou trase pwoteyin omolog la nan S. sclerotiorum (taksid: 5180). Yo te fè BLASTp avèk done jenòm S. sclerotiorum ki pi resan ki disponib nan GenBank sou sitwèb Sant Nasyonal pou Enfòmasyon sou Byoteknoloji (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Anplis de sa, yo te dedwi jèn OAH prevwa ki soti nan S. sclerotiorum (SsOAH) ansanm ak analiz evolisyonè ak pyebwa filojenetik AfOAH ki soti nan A. fijiensis CBS 313.89 ak PlOAH ki soti nan P. lagena lè l sèvi avèk metòd maksimòm pwobabilite nan MEGA11 (Tamura et al., 2021) ak modèl ki baze sou matris JTT a (Jones et al., 1992). Yo te konbine pyebwa filojenetik la avèk analiz aliyman miltip sekans pwoteyin tout jèn OAH prevwa (SsOAH) ki soti nan S. sclerotiorum ak sekans rechèch la lè l sèvi avèk Zouti Aliyman ki Baze sou Kontrent (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ak Agarwala, 2007). Anplis de sa, sekans asid amine SsOAH ki pi byen koresponn ak S. sclerotiorum yo te aliyen ak sekans rechèch yo (AfOAH ak PlOAH) (Larkin et al., 2007) lè l sèvi avèk ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), epi rejyon konsève nan aliyman an te vizyalize lè l sèvi avèk zouti ESPript la (vèsyon 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Anplis, domèn reprezantan fonksyonèl prevwa yo ak sit konsève S. sclerotiorum SsOAH yo te klase entèaktivman nan diferan fanmi lè l sèvi avèk zouti InterPro a (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Finalman, modèl estrikti twa dimansyon (3D) S. sclerotiorum SsOAH prevwa a te fèt lè l sèvi avèk Pwoteyin Omoloji/Analoji Rekonesans Motè (sèvè Phyre2 vèsyon 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) epi valide lè l sèvi avèk sèvè SWISS-MODEL la (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Yo te vizyalize estrikti twa dimansyon yo te prevwa yo (fòma PDB) yon fason entèaktif lè l sèvi avèk pake UCSF-Chimera a (vèsyon 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Yo te itilize PCR fliyoresans kantitatif an tan reyèl pou detèmine nivo transkripsyonèl oksaloacetat asetilhidrolaz (SsOAH; nimewo aksè GenBank: XM_001590428.1) nan miselyòm Sclerotinia sclerotiorum. An brèf, yo te inokile S. sclerotiorum nan yon flakon ki gen PDB epi yo te mete l nan yon enkibatè k ap souke (modèl: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) a 25 ± 2 °C pandan 24 èdtan a 150 rpm epi nan fènwa konstan (24 èdtan) pou estimile kwasans miselyòm. Apre sa, yo te trete selil yo ak L-ornitin ak fonjisid Rizolex-T nan konsantrasyon final IC50 (apeprè 40 ak 3.2 mg/L, respektivman) epi answit yo te kiltive yo pandan yon lòt 24 èdtan nan menm kondisyon yo. Apre enkubasyon an, kilti yo te santrifije a 2500 rpm pandan 5 minit epi yo te kolekte sipènatant la (miselyòm chanpiyon an) pou analiz ekspresyon jèn. Menm jan an tou, yo te kolekte miselyòm chanpiyon an a 0, 24, 48, 72, 96, ak 120 èdtan apre enfeksyon an nan plant enfekte ki te fòme mwazi blan ak miselyòm koton sou sifas tisi enfekte yo. Yo te ekstrè ARN nan miselyòm chanpiyon an epi answit yo te sentetize ADNc jan sa dekri pi wo a. Sekans primè pou SsOAH yo nan Tablo Siplemantè S3. Yo te itilize SsActin (nimewo aksè GenBank: XM_001589919.1) kòm jèn entèn, epi yo te kalkile ekspresyon jèn relatif la lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCT la (Livak ak Schmittgen, 2001).
Yo te detèmine asid oksalik nan bouyon dekstròz pòmdetè (PDB) ak echantiyon plant ki genyen patojèn chanpiyon Sclerotinia sclerotiorum nan dapre metòd Xu ak Zhang (2000) avèk ti modifikasyon. An brèf, yo te inokile izolat S. sclerotiorum yo nan flakon ki genyen PDB epi answit yo te kiltive yo nan yon enkibatè ki t ap souke (modèl I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) nan 150 rpm nan 25 ± 2 °C pandan 3-5 jou nan fènwa konstan (24 èdtan) pou ankouraje kwasans miselyòm. Apre enkubasyon an, yo te premye filtre kilti chanpiyon an nan papye filtè Whatman #1 epi answit santrifije l nan 2500 rpm pandan 5 minit pou retire miselyòm ki rete a. Yo te kolekte epi estoke sipènatant la nan 4°C pou plis detèminasyon kantitatif oksalat. Pou preparasyon echantiyon plant yo, yo te ekstrè apeprè 0.1 g fragman tisi plant twa fwa avèk dlo distile (2 ml chak fwa). Apre sa, echantiyon yo te santrifije a 2500 rpm pandan 5 minit, sipènatant la te filtre a sec atravè papye filtè Whatman No 1 epi yo te kolekte li pou plis analiz.
Pou analiz kantitatif asid oksalik la, melanj reyaksyon an te prepare nan yon tib ak bouchon an vè nan lòd sa a: 0.2 ml echantiyon (oswa filtrat kilti PDB oswa solisyon estanda asid oksalik), 0.11 ml ble bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml asid silfirik 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ak 0.176 ml dikromat potasyòm 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), epi answit solisyon an te delye a 4.8 ml ak dlo distile, melanje byen fò epi mete imedyatman nan yon beny dlo 60 °C. Apre 10 min, reyaksyon an te kanpe lè yo te ajoute 0.5 ml solisyon idroksid sodyòm (NaOH; 0.75 M). Yo te mezire absòbans (A600) melanj reyaksyon an nan 600 nm avèk yon espektrofotomèt UV-160 (Shimadzu Corporation, Japon). Yo te itilize PDB ak dlo distile kòm kontwòl pou kantifikasyon filtrat kilti yo ak echantiyon plant yo, respektivman. Konsantrasyon asid oksalik nan filtrat kilti yo, eksprime kòm mikwogram asid oksalik pou chak mililit medyòm PDB (μg.mL−1), ak nan ekstrè fèy yo, eksprime kòm mikwogram asid oksalik pou chak gram pwa fre (μg.g−1 FW), yo te detèmine lè l sèvi avèk yon koub kalibrasyon asid oksalik (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, Etazini).
Pandan tout etid la, tout eksperyans yo te fèt nan yon konsepsyon konplètman owaza (CRD) ak sis replikasyon byolojik pou chak tretman ak senk po pou chak replikasyon byolojik (de plant pou chak po) sof si yo endike otreman. Replikasyon byolojik yo te analize an doub (de replikasyon teknik). Replikasyon teknik yo te itilize pou verifye repwodiktibilite menm eksperyans lan men yo pa t itilize yo nan analiz estatistik la pou evite replikasyon fo. Done yo te analize estatistikman lè l sèvi avèk analiz varyans (ANOVA) ki te swiv pa tès diferans onètman siyifikatif Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). Pou eksperyans in vitro yo, valè IC50 ak IC99 yo te kalkile lè l sèvi avèk modèl probit la epi entèval konfyans 95% yo te kalkile.
Yo te kolekte yon total kat izolat nan diferan jaden soya nan Gouvènman El Ghabiya, nan peyi Lejip. Sou medyòm PDA a, tout izolat yo te pwodui miselyòm blan krèm ki te byen vit vin blan koton (Figi 1A) epi answit bèj oswa mawon nan etap sklerotyòm nan. Skleroti yo anjeneral dans, nwa, esferik oswa iregilye nan fòm, 5.2 a 7.7 mm longè ak 3.4 a 5.3 mm an dyamèt (Figi 1B). Malgre ke kat izolat te devlope yon modèl skleroti majinal nan kwen medyòm kilti a apre 10-12 jou enkubasyon nan 25 ± 2 °C (Fig. 1A), kantite skleroti pa plak te siyifikativman diferan nan mitan yo (P < 0.001), ak izolat 3 ki te gen pi gwo kantite skleroti (32.33 ± 1.53 skleroti pa plak; Fig. 1C). Menm jan an tou, izolat #3 a te pwodui plis asid oksalik nan PDB pase lòt izolat yo (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Izolat #3 a te montre karakteristik mòfolojik ak mikwoskopik tipik chanpiyon fitopatojèn Sclerotinia sclerotiorum nan. Pa egzanp, sou PDA, koloni izolat #3 yo te grandi rapidman, yo te blan krèm (Figi 1A), bèj envès oswa jòn-mawon somon pal, epi yo te bezwen 6-7 jou nan 25 ± 2°C pou kouvri nèt sifas yon plak 9 cm dyamèt. Baze sou karakteristik mòfolojik ak mikwoskopik ki anwo yo, yo te idantifye izolat #3 kòm Sclerotinia sclerotiorum.
Figi 1. Karakteristik ak patojenikite izolat S. sclerotiorum ki soti nan rekòt legim komen. (A) Kwasans miselyal kat izolat S. sclerotiorum sou mwayen PDA, (B) skleroti kat izolat S. sclerotiorum, (C) kantite skleroti (pa plak), (D) sekresyon asid oksalik sou mwayen PDB (μg.mL−1), ak (E) gravite maladi a (%) nan kat izolat S. sclerotiorum sou kiltivatè legim komèsyal sansib Giza 3 anba kondisyon sèr. Valè yo reprezante mwayèn ± SD senk replikasyon byolojik (n = 5). Lèt diferan endike diferans estatistikman siyifikatif ant tretman yo (p < 0.05). (F–H) Sentòm mwazi blan tipik yo te parèt sou tij ak silik ki anlè tè a, respektivman, 10 jou apre inokilasyon ak izolat #3 (dpi). (I) Yo te fè analiz evolisyon rejyon espasè transkri entèn (ITS) izolat S. sclerotiorum #3 la lè l sèvi avèk metòd maksimòm pwobabilite a epi yo te konpare l ak 20 izolat/souch referans yo te jwenn nan baz done Sant Nasyonal pou Enfòmasyon sou Byoteknoloji (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Chif ki anlè liy gwoupman yo endike kouvèti rejyon an (%), epi chif ki anba liy gwoupman yo endike longè branch lan.
Anplis, pou konfime patojenikite a, kat izolat S. sclerotiorum yo te jwenn te itilize pou inokile kiltivatè pwa komèsyal Giza 3 ki sansib a anba kondisyon sèr, sa ki konsistan avèk postula Koch yo (Fig. 1E). Malgre ke tout izolat chanpiyon yo te jwenn yo te patojèn epi yo te kapab enfekte pwa vèt la (cv. Giza 3), sa ki te lakòz sentòm mwazi blan tipik sou tout pati ki anlè tè a (Fig. 1F), espesyalman sou tij yo (Fig. 1G) ak gous yo (Fig. 1H) 10 jou apre inokilasyon an (dpi), izolat 3 te izolat ki pi agresif la nan de eksperyans endepandan. Izolat 3 te gen pi gwo gravite maladi a (%) sou plant pwa (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, ak 76.7 ± 3.1 nan 7, 14, ak 21 jou apre enfeksyon an, respektivman; Figi 1F).
Yo te konfime idantifikasyon izolat S. sclerotiorum #3 ki pi anvayisan an plis toujou, baze sou sekansaj espasè transkri entèn (ITS) (Fig. 1I). Analiz filojenetik ant izolat #3 ak 20 izolat/souch referans yo te montre yon gwo resanblans (>99%) ant yo. Li enpòtan pou note ke izolat S. sclerotiorum #3 (533 bp) la gen yon gwo resanblans ak izolat S. sclerotiorum Ameriken LPM36 ki te izole nan grenn pwa sèk (nimewo aksè GenBank MK896659.1; 540 bp) ak izolat S. sclerotiorum Chinwa YKY211 (nimewo aksè GenBank OR206374.1; 548 bp), ki lakòz pouriti tij vyolèt (Matthiola incana), yo tout gwoupe separeman nan tèt dendrogram nan (Figi 1I). Yo depoze nouvo sekans lan nan baz done NCBI a epi yo rele l "Sclerotinia sclerotiorum - izolat YN-25" (nimewo aksè GenBank PV202792). Nou ka wè ke izolat 3 a se izolat ki pi anvayisan an; kidonk, yo te chwazi izolat sa a pou etidye nan tout eksperyans ki vin apre yo.
Yo te envestige aktivite antibakteri diamin L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almay) nan diferan konsantrasyon (12.5, 25, 50, 75, 100 ak 125 mg/L) kont izolat S. sclerotiorum 3 in vitro. Li enpòtan pou note ke L-ornitin te egzèse yon efè antibakteri epi piti piti li te inibi kwasans radyal if S. sclerotiorum yo nan yon fason ki depann de dòz la (Figi 2A, B). Nan pi gwo konsantrasyon yo te teste a (125 mg/L), L-ornitin te demontre pi gwo to inibisyon kwasans miselyèl la (99.62 ± 0.27%; Figi 2B), ki te ekivalan ak fonjisid komèsyal Rizolex-T a (to inibisyon 99.45 ± 0.39%; Figi 2C) nan pi gwo konsantrasyon yo te teste a (10 mg/L), sa ki endike yon efikasite ki sanble.
Figi 2. Aktivite antibakteri in vitro L-ornitin kont Sclerotinia sclerotiorum. (A) Konparezon aktivite antibakteri diferan konsantrasyon L-ornitin kont S. sclerotiorum ak fonjisid komèsyal Rizolex-T a (10 mg/L). (B, C) To inibisyon (%) kwasans miselyèl S. sclerotiorum apre tretman ak diferan konsantrasyon L-ornitin (12.5, 25, 50, 75, 100 ak 125 mg/L) oswa Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ak 10 mg/L), respektivman. Valè yo reprezante mwayèn ± SD senk replikasyon byolojik (n = 5). Lèt diferan yo endike diferans estatistik ant tretman yo (p < 0.05). (D, E) Analiz regresyon modèl probit L-ornitin ak fonjisid komèsyal Rizolex-T a, respektivman. Liy regresyon modèl probit la parèt kòm yon liy ble solid, epi entèval konfyans lan (95%) parèt kòm yon liy wouj tirete.
Anplis de sa, yo te fè yon analiz regresyon probit epi graf korespondan yo montre nan Tablo 1 ak Figi 2D,E. An brèf, valè pant akseptab la (y = 2.92x − 4.67) ak estatistik siyifikatif ki asosye yo (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ak p < 0.0001; Figi 2D) L-ornitin te endike yon aktivite antifonjik amelyore kont S. sclerotiorum konpare ak fonjisid komèsyal Rizolex-T la (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ak p < 0.0001) (Tablo 1).
Tablo 1. Valè konsantrasyon inibitwa mwatye maksimòm (IC50) ak IC99 (mg/l) L-ornitin ak fonjisid komèsyal "Rizolex-T" kont S. sclerotiorum.
An jeneral, L-ornitin (250 mg/L) te diminye devlopman ak gravite mwazi blan an sou plant pwa komen trete yo konpare ak plant ki enfekte ak S. sclerotiorum ki pa t trete yo (kontwòl; Figi 3A). An brèf, byenke gravite maladi a nan plant kontwòl ki enfekte ki pa t trete yo te ogmante piti piti (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ak 92.33 ± 3.06%), L-ornitin te diminye gravite maladi a (%) anpil pandan tout eksperyans lan (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ak 26.36 ± 3.07) nan 7, 14, ak 21 jou apre tretman an (dpt), respektivman (Figi 3A). Menm jan an tou, lè plant pwa ki enfekte ak S. sclerotiorum yo te trete ak 250 mg/L L-ornitin, zòn anba koub pwogresyon maladi a (AUDPC) te diminye soti nan 1274.33 ± 33.13 nan kontwòl ki pa t trete a pou rive nan 281.03 ± 7.95, ki te yon ti kras pi ba pase sa ki nan kontwòl pozitif 50 mg/L fonjisid Rizolex-T a (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). Menm tandans lan te obsève nan dezyèm eksperyans lan.
Fig. 3. Efè aplikasyon ekzojèn L-ornitin sou devlopman pouri blan pwa komen ki koze pa Sclerotinia sclerotiorum anba kondisyon sèr. (A) Koub pwogresyon maladi mwazi blan pwa komen apre tretman ak 250 mg/L L-ornitin. (B) Zòn anba koub pwogresyon maladi a (AUDPC) mwazi blan pwa komen apre tretman ak L-ornitin. Valè yo reprezante mwayèn ± SD senk replikasyon byolojik (n = 5). Lèt diferan endike diferans estatistikman siyifikatif ant tretman yo (p < 0.05).
Aplikasyon ekzojèn 250 mg/L L-ornitin te ogmante piti piti wotè plant lan (Fig. 4A), kantite branch pa plant (Fig. 4B), ak kantite fèy pa plant (Fig. 4C) apre 42 jou. Pandan ke fonjisid komèsyal Rizolex-T (50 mg/L) te gen pi gwo efè sou tout paramèt nitrisyonèl yo etidye yo, aplikasyon ekzojèn 250 mg/L L-ornitin te gen dezyèm pi gwo efè konpare ak temwen ki pa trete yo (Fig. 4A-C). Yon lòt bò, tretman L-ornitin lan pa t gen okenn efè siyifikatif sou kontni pigman fotosentetik klowofil a (Fig. 4D) ak klowofil b (Fig. 4E), men li te ogmante kontni total karotenoid la yon ti kras (0.56 ± 0.03 mg/g pwa fr) konpare ak kontwòl negatif la (0.44 ± 0.02 mg/g pwa fr) ak kontwòl pozitif la (0.46 ± 0.02 mg/g pwa fr; Fig. 4F). An jeneral, rezilta sa yo endike ke L-ornitin pa fitotoksik pou legim trete yo e li ka menm estimile kwasans yo.
Fig. 4. Efè aplikasyon L-ornitin ekzojèn sou karakteristik kwasans ak pigman fotosentetik fèy pwa enfekte ak Sclerotinia sclerotiorum anba kondisyon sèr. (A) Wotè plant (cm), (B) Kantite branch pa plant, (C) Kantite fèy pa plant, (D) Kontni klowofil a (mg g-1 fr wt), (E) Kontni klowofil b (mg g-1 fr wt), (F) Kontni total karotenoid (mg g-1 fr wt). Valè yo se mwayèn ± SD senk replikasyon byolojik (n = 5). Lèt diferan endike diferans estatistikman siyifikatif ant tretman yo (p < 0.05).
Lokalizasyon istochimik in situ espès oksijèn reyaktif (ROS; eksprime kòm oksijene idwojèn [H2O2]) ak radikal lib (eksprime kòm anyon siperoksid [O2•−]) te revele ke aplikasyon ekzojèn L-ornitin (250 mg/L) te siyifikativman redwi akimilasyon H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) ak O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) konpare ak akimilasyon tou de plant enfekte ki pa trete (173.31 ± 12.06 ak 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, respektivman) ak plant trete ak 50 mg/L fonjisid komèsyal Rizolex-T a (170.12 ± 9.50 ak 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, respektivman) nan 72 èdtan. Gwo nivo H2O2 ak O2•− te akimile anba hpt (Fig. 5A, B). Menm jan an tou, tès malondialdeyid (MDA) ki baze sou TCA te montre ke plant pwa ki enfekte ak S. sclerotiorum te akimile pi gwo nivo MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) nan fèy yo (Fig. 5C). Sepandan, aplikasyon ekzojèn L-ornitin te redwi peroksidasyon lipid la yon fason siyifikatif jan diminisyon nan kontni MDA nan plant trete yo te montre sa (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efè aplikasyon L-ornitin ekzojèn sou makè prensipal estrès oksidatif ak mekanis defans antioksidan ki pa anzimatik nan fèy pwa enfekte ak S. sclerotiorum 72 èdtan apre enfeksyon anba kondisyon sèr. (A) Pèwoksid idwojèn (H2O2; nmol g−1 FW) nan 72 hpt, (B) anyon siperoksid (O2•−; nmol g−1 FW) nan 72 hpt, (C) malondialdeyid (MDA; nmol g−1 FW) nan 72 hpt, (D) total fenòl idrosolubl (mg GAE g−1 FW) nan 72 hpt, (E) total flavonoid idrosolubl (mg RE g−1 FW) nan 72 hpt, (F) total asid amine lib (mg g−1 FW) nan 72 hpt, ak (G) kontni prolin (mg g−1 FW) nan 72 hpt. Valè yo reprezante mwayèn ± devyasyon estanda a (mwayèn ± SD) nan 5 replikasyon byolojik (n = 5). Lèt diferan endike diferans estatistikman siyifikatif ant tretman yo (p < 0.05).