Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa gen sipò limite pou CSS. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript.
Nanopartikil ensilin (NP) ki gen yon gwo kantite chaj te jwenn diferan aplikasyon nan diferan fòm dòz. Travay sa a gen pou objaktif pou evalye efè pwosesis siye pa friz ak siye pa espre sou estrikti nanopartikil kitosan ki chaje ak ensilin, avèk oswa san manitol kòm yon kriyopwotektè. Nou te evalye tou kalite nanopartikil sa yo lè nou te redisoli yo. Anvan dezidratasyon, gwosè patikil nanopartikil kitosan/tripolifosfat sodyòm/ensilin ki lye kwaze yo te optimize pou 318 nm, PDI a te 0.18, efikasite enkapsulasyon an te 99.4%, epi chaj la te 25.01%. Apre rekonstitisyon, tout nanopartikil yo, eksepte sa yo ki pwodui pa yon metòd siye pa friz san itilizasyon manitol, te kenbe estrikti patikil esferik yo. Konpare ak nanopartikil ki gen manitol ki dezidrate pa swa espre, nanopartikil ki seche pa espre san manitol yo te montre tou pi piti gwosè patikil mwayèn (376 nm) ak pi gwo kantite chaj. (25.02%) ak yon to enkapsulasyon menm jan an (98.7%) ak PDI (0.20) pa teknik siye oswa siye pa frizè. Nanopartikil seche yo pa siye espre san manitol te lakòz tou liberasyon ensilin ki pi rapid la ak pi gwo efikasite absòpsyon selilè a. Travay sa a montre ke siye espre ka dezidrate nanopartikil ensilin san yo pa bezwen kriyopwotektè konpare ak metòd siye pa frizè konvansyonèl yo, sa ki kreye yon pi gwo kapasite chaj, mwens bezwen aditif ak yon avantaj siyifikatif nan depans fonksyònman.
Depi yo te dekouvri l an 19221,2,3, ensilin ak preparasyon famasetik li yo sove lavi pasyan ki gen dyabèt tip 1 (T1DM) ak dyabèt tip 2 (T1DM). Sepandan, akòz pwopriyete li kòm yon pwoteyin ki gen gwo pwa molekilè, ensilin fasil pou rasanble, anzim pwoteyolitik yo kraze l, epi elimine l pa efè premye pasaj la. Moun ki gen dyabèt tip 1 bezwen piki ensilin pou tout rès vi yo. Anpil pasyan ki te gen dyabèt tip 2 okòmansman bezwen piki ensilin alontèm tou. Piki ensilin chak jou yo se yon gwo sous doulè ak malèz chak jou pou moun sa yo, ak efè negatif sou sante mantal. Kòm rezilta, lòt fòm administrasyon ensilin ki lakòz mwens malèz, tankou administrasyon ensilin oral, yo ap etidye anpil5 paske yo gen potansyèl pou retabli kalite lavi apeprè 5 milya moun ki gen dyabèt atravè lemond.
Teknoloji nanopartikil la te bay yon avansman siyifikatif nan tantativ pou pran ensilin oral4,6,7. Youn ki ankapsule epi pwoteje ensilin efektivman kont degradasyon pou livrezon siblé nan zòn espesifik nan kò a. Sepandan, itilizasyon fòmilasyon nanopartikil yo gen plizyè limitasyon, sitou akòz pwoblèm estabilite sispansyon patikil yo. Gen kèk agregasyon ki ka rive pandan depo, sa ki diminye byodisponibilite nanopartikil chaje ak ensilin8. Anplis de sa, estabilite chimik matris polimè nanopartikil yo ak ensilin lan dwe konsidere tou pou asire estabilite nanopartikil ensilin (NP) yo. Kounye a, teknoloji siye pa konjelasyon se estanda an lò pou kreye NP ki estab pandan y ap anpeche chanjman endezirab pandan depo9.
Sepandan, siye pa frizè mande pou ajoute kriyopwotektè pou anpeche estrikti esferik NP yo afekte pa estrès mekanik kristal glas yo. Sa diminye anpil chaj nanopartikil ensilin yo apre liofilizasyon, paske kriyopwotektè a okipe pi fò nan rapò pwa a. Se poutèt sa, NP ensilin ki pwodui yo souvan pa apwopriye pou fabrike fòmilasyon poud sèk, tankou tablèt oral ak fim oral, akòz bezwen pou gwo kantite nanopartikil sèk pou reyalize fenèt terapetik ensilin lan.
Siye espre se yon pwosesis byen koni e ki pa chè sou echèl endistriyèl pou pwodui poud sèk apati faz likid nan endistri famasetik la10,11. Kontwòl sou pwosesis fòmasyon patikil la pèmèt yon bon enkapsulasyon plizyè konpoze bioaktif 12, 13. Anplis de sa, li vin tounen yon teknik efikas pou preparasyon pwoteyin enkapsule pou administrasyon oral. Pandan siye espre a, dlo evapore trè vit, sa ki ede kenbe tanperati nwayo patikil la ba11,14, sa ki pèmèt aplikasyon li pou enkapsule konpozan sansib a chalè. Anvan siye espre a, materyèl kouch la ta dwe byen omojeneize ak solisyon ki gen engredyan enkapsule yo11,14. Kontrèman ak siye pa konjelasyon, omojenizasyon anvan enkapsulasyon nan siye espre amelyore efikasite enkapsulasyon pandan dezidratasyon. Piske pwosesis enkapsulasyon siye espre a pa bezwen kriyopwotektè, yo ka itilize siye espre pou pwodui NP sèk ak yon kontni chaj ki wo.
Etid sa a rapòte pwodiksyon NP chaje ak ensilin pa kwa-lyezon kitosan ak tripolifosfat sodyòm lè l sèvi avèk yon metòd jèl iyon. Jelasyon iyon se yon metòd preparasyon ki pèmèt pwodiksyon nanopartikil atravè entèraksyon elektwostatik ant de oswa plis espès iyonik anba sèten kondisyon. Tou de teknik siye-konjelasyon ak siye-espre yo te itilize pou dezidrate nanopartikil kitosan/tripolifosfat sodyòm/ensilin ki lye kwaze yo. Apre dezidratasyon, yo te analize mòfoloji yo pa SEM. Yo te evalye kapasite rekombinasyon yo lè yo te mezire distribisyon gwosè yo, chaj sifas yo, PDI, efikasite enkapsulasyon, ak kontni chaj. Yo te evalye tou kalite nanopartikil rezolibilize ki pwodui pa diferan metòd dezidratasyon yo lè yo te konpare pwoteksyon ensilin yo, konpòtman liberasyon, ak efikasite absòpsyon selilè yo.
pH solisyon melanje a ak rapò kitosan ak ensilin se de faktè kle ki afekte gwosè patikil ak efikasite enkapsulasyon (EE) NP final yo, paske yo afekte dirèkteman pwosesis jelasyon ionotropik la. Yo te montre pH solisyon melanje a gen yon gwo korelasyon ak gwosè patikil ak efikasite enkapsulasyon (Fig. 1a). Jan yo montre nan Fig. 1a, lè pH la ogmante soti nan 4.0 pou rive nan 6.0, gwosè mwayèn patikil la (nm) diminye epi EE a ogmante anpil, alòske lè pH la ogmante a 6.5, gwosè mwayèn patikil la kòmanse ogmante epi EE a rete san chanjman. Lè rapò kitosan ak ensilin ogmante, gwosè mwayèn patikil la ogmante tou. Anplis de sa, yo pa obsève okenn chanjman nan EE lè yo te prepare nanopartikil yo nan yon rapò mas kitosan/ensilin ki pi wo pase 2.5:1 (p/p) (Fig. 1b). Se poutèt sa, yo te itilize kondisyon preparasyon optimal nan etid sa a (pH 6.0, rapò mas kitosan/ensilin 2.5:1). pou prepare nanopartikil chaje ak ensilin pou plis etid. Anba kondisyon preparasyon sa a, gwosè patikil mwayèn nanopartikil ensilin yo te optimize pou 318 nm (Fig. 1c), PDI a te 0.18, efikasite entegrasyon an te 99.4%, potansyèl zeta a te 9.8 mv, epi chaj ensilin lan te 25.01% (m/m). Baze sou rezilta mikwoskòp elektwonik transmisyon (TEM), nanopartikil optimize yo te apeprè esferik ak diskrè ak gwosè relativman inifòm (Fig. 1d).
Optimizasyon paramèt nanopartikil ensilin: (a) efè pH sou dyamèt mwayèn ak efikasite enkapsulasyon (EE) nanopartikil ensilin (prepare nan yon rapò mas 5:1 ant kitosan ak ensilin); (b) kitosan ak enfliyans rapò mas ensilin sou dyamèt mwayèn ak efikasite enkapsulasyon (EE) nanopartikil ensilin (prepare nan pH 6); (c) distribisyon gwosè patikil nanopartikil ensilin optimize yo; (d) mikwografi TEM nan nanopartikil ensilin optimize yo.
Li byen koni ke kitosan se yon polielektwolit fèb ak yon pKa 6.5. Li chaje pozitivman nan medya asid paske gwoup amino prensipal li a pwotonize pa iyon idwojèn15. Se poutèt sa, li souvan itilize kòm yon transpòtè pou ankapsule makromolekil chaje negatif. Nan etid sa a, yo te itilize kitosan pou ankapsule ensilin ak yon pwen izoelektrik 5.3. Piske yo itilize kitosan kòm yon materyèl kouch, ak ogmantasyon pwopòsyon li, epesè kouch ekstèn nanopartikil yo ogmante korespondan, sa ki lakòz yon gwosè patikil mwayèn ki pi gwo. Anplis de sa, nivo kitosan ki pi wo ka ankapsule plis ensilin. Nan ka nou an, EE te pi wo lè rapò kitosan ak ensilin te rive nan 2.5:1, epi pa te gen okenn chanjman siyifikatif nan EE lè rapò a te kontinye ogmante.
Anplis rapò kitosan ak ensilin, pH la te jwe yon wòl enpòtan tou nan preparasyon NP yo. Gan et al. 17 te etidye efè pH la sou gwosè patikil nanopartikil kitosan yo. Yo te jwenn yon diminisyon kontinyèl nan gwosè patikil la jiskaske pH la te rive nan 6.0, epi yo te obsève yon ogmantasyon siyifikatif nan gwosè patikil la nan pH > 6.0, ki konsistan avèk obsèvasyon nou yo. Fenomèn sa a se akòz lefèt ke lè pH la ogmante, molekil ensilin lan vin gen yon chaj sifas negatif, kidonk, li favorize entèraksyon elektwostatik ak konplèks kitosan/tripolifosfat sodyòm (TPP) la, sa ki lakòz yon ti gwosè patikil ak yon EE ki wo. Sepandan, lè yo te ajiste pH la a 6.5, gwoup amino yo sou kitosan an te deprotone, sa ki te lakòz kitosan an pliye. Kidonk, yon pH ki wo lakòz mwens ekspozisyon iyon amino yo a TPP ak ensilin, sa ki lakòz yon pi ba lyezon kwaze, yon pi gwo gwosè patikil mwayèn final ak yon EE ki pi ba.
Analiz pwopriyete mòfolojik NP ki te seche pa frizè ak ki te seche pa espre ka gide seleksyon pi bon teknik dezidratasyon ak fòmasyon poud. Metòd ki pi pito a ta dwe bay estabilite dwòg, fòm patikil inifòm, gwo chaj dwòg ak bon solubilite nan solisyon orijinal la. Nan etid sa a, pou pi byen konpare de teknik yo, yo te itilize NP ensilin avèk oswa san 1% mannitol pandan dezidratasyon an. Yo itilize mannitol kòm yon ajan ankonbran oswa kriyopwotektè nan divès fòmilasyon poud sèk pou siye pa frizè ak siye pa espre. Pou nanopartikil ensilin liyofilize san mannitol, jan yo montre nan Figi 2a, yo te obsève yon estrikti poud trè pore ak sifas gwo, iregilye ak ki graj anba mikwoskòp elektwonik optik (SEM). Yo te detekte kèk patikil disrè nan poud lan apre dezidratasyon an (Fig. 2e). Rezilta sa yo endike ke pifò NP yo te dekonpoze pandan siye pa frizè san okenn kriyopwotektè. Pou nanopartikil ensilin ki te seche pa frizè ak ki te seche pa espre ki gen 1% mannitol, yo te obsève nanopartikil esferik ak sifas lis (Fig. 2b,d,f,h). Nanopartikil ensilin ki te seche pa espre san manitol te rete esferik men ride sou sifas la (Fig. 2c). Sifas esferik ak ride yo diskite plis nan konpòtman liberasyon ak tès absòpsyon selilè ki anba yo. Baze sou aparans vizib NP seche yo, tou de NP seche pa espre san manitol ak NP seche pa konjelasyon ak seche pa espre ak manitol te bay poud NP amann (Fig. 2f,g,h). Plis sifas ant sifas patikil yo gwo, se plis solubilite a wo e pakonsekan, se plis vitès liberasyon an wo.
Mòfoloji diferan nanopartikil ensilin dezidrate: (a) imaj SEM nanopartikil ensilin liofilize san manitol; (b) imaj SEM nanopartikil ensilin liofilize ak manitol; (c) nanopartikil ensilin seche pa espre san manitol Imaj SEM; (d) imaj SEM nanopartikil ensilin seche pa espre ak manitol; (e) imaj poud nanopartikil ensilin liofilize san manitol; (f) imaj nanopartikil ensilin liofilize ak manitol; (g) Imaj poud nanopartikil ensilin seche pa espre san manitol; (h) imaj poud nanopartikil ensilin seche pa espre ak manitol.
Pandan siye pa konjelasyon, manitol aji kòm yon kriyopwotektè, li kenbe NP yo nan yon fòm amorf epi li anpeche domaj ki koze pa kristal glas yo19. Okontrè, pa gen okenn etap konjelasyon pandan siye pa espre. Se poutèt sa, manitol pa nesesè nan metòd sa a. Anfèt, NP ki seche pa espre san manitol te bay NP ki pi rafine jan sa te dekri deja. Sepandan, manitol ka toujou aji kòm yon ranpli nan pwosesis siye pa espre a pou bay NP yo yon estrikti ki pi esferik20 (Fig. 2d), ki ede jwenn yon konpòtman liberasyon inifòm nan NP ki ankapsule sa yo. Anplis de sa, li klè ke yo ka detekte kèk gwo patikil nan tou de NP ensilin ki seche pa konjelasyon ak ki seche pa espre ki gen manitol (Fig. 2b,d), ki ka akòz akimilasyon manitol nan nwayo patikil la ansanm ak ensilin ki ankapsule a. Kouch kitosan an. Li enpòtan pou note ke nan etid sa a, pou asire ke estrikti esferik la rete entak apre dezidratasyon, rapò mannitol ak kitosan an kenbe nan 5:1, pou yon gwo kantite filler kapab ogmante gwosè patikil NP seche yo tou.
Espèktroskopi refleksyon total atenye pa transfòmasyon Fourier enfrawouj (FTIR-ATR) te karakterize melanj fizik ensilin lib, kitosan, kitosan, TPP ak ensilin. Tout NP dezidrate yo te karakterize lè l sèvi avèk espèktroskopi FTIR-ATR. Li enpòtan pou note ke entansite bann 1641, 1543 ak 1412 cm-1 yo te obsève nan NP ankapsule ki te seche pa friz ak manitol ak nan NP ki te seche pa espre ak oswa san manitol (Fig. 3). Jan yo te rapòte deja, ogmantasyon sa yo nan fòs te asosye avèk lyezon kwaze ant kitosan, TPP ak ensilin. Envestigasyon sou entèraksyon ant kitosan ak ensilin te montre ke nan espèk FTIR nanopartikil kitosan chaje ak ensilin, bann kitosan an te sipèpoze ak sa ki nan ensilin, sa ki ogmante entansite kabonil (1641 cm-1) ak senti amin (1543 cm-1). Gwoup tripolifosfat TPP yo lye ak gwoup amonyòm nan kitosan, fòme yon bann nan 1412 cm-1.
Espèk FTIR-ATR ensilin lib, kitosan, melanj fizik kitosan/TPP/ensilin ak NP dezidrate pa diferan metòd.
Anplis de sa, rezilta sa yo konsistan avèk sa yo montre nan SEM, ki te montre ke NP ankapsule yo te rete entak ni lè yo te flite ak friz-seche ak manitol, men san manitol, se sèlman siye espre ki te pwodui patikil ankapsule. Okontrè, rezilta espektral FTIR-ATR NP friz-seche san manitol te trè menm jan ak melanj fizik kitosan, TPP, ak ensilin. Rezilta sa a endike ke lyen kwaze ant kitosan, TPP ak ensilin pa prezan ankò nan NP friz-seche san manitol. Estrikti NP yo te detwi pandan friz-seche san kriyopwotektè, sa ki ka wè nan rezilta SEM yo (Fig. 2a). Baze sou mòfoloji ak rezilta FTIR NP ensilin dezidrate yo, se sèlman NP liofilize, friz-seche, ak san manitol yo te itilize pou eksperyans rekonstitisyon ak NP san manitol akòz dekonpozisyon NP san manitol pandan dezidratasyon. diskite.
Dezidratasyon yo itilize pou depo alontèm ak pou yo trete yo nan lòt fòmilasyon. Kapasite NP sèk yo pou rekonstitye apre depo enpòtan anpil pou itilizasyon yo nan diferan fòmilasyon tankou tablèt ak fim. Nou remake gwosè patikil mwayèn NP ensilin seche pa espre san mannitol ogmante sèlman yon ti kras apre rekonstitisyon. Nan lòt men an, gwosè patikil nanopartikil ensilin seche pa espre ak konjele ak mannitol ogmante anpil (Tablo 1). PDI ak EE pa chanje anpil (p > 0.05) apre rekombinasyon tout NP yo nan etid sa a (Tablo 1). Rezilta sa a endike ke pifò patikil yo rete entak apre yo fin fonn ankò. Sepandan, adisyon mannitol la lakòz yon gwo rediksyon nan chaj ensilin nan nanopartikil mannitol liofilize ak seche pa espre (Tablo 1). Okontrè, kontni chaj ensilin NP seche pa espre san mannitol rete menm jan ak anvan (Tablo 1).
Li byen koni ke chaj nanopartikil yo enpòtan anpil lè yo itilize pou administrasyon dwòg. Pou NP ki gen chaj ki ba, yo bezwen gwo kantite materyèl pou rive nan papòt ki ka geri a. Sepandan, gwo viskozite konsantrasyon NP sa yo ki wo mennen nan deranjman ak difikilte nan administrasyon oral ak fòmilasyon enjektab, respektivman 22. Anplis de sa, NP ensilin yo kapab itilize tou pou fè grenn ak biofilm gluan23, 24, ki mande pou itilize gwo kantite NP nan nivo chaj ki ba, sa ki lakòz gwo grenn ak biofilm epè ki pa apwopriye pou aplikasyon oral. Se poutèt sa, NP dezidrate ki gen yon chaj ensilin ki wo yo trè dezirab. Rezilta nou yo sijere ke gwo chaj ensilin NP ki seche pa espre san mannitol yo ka ofri anpil avantaj atiran pou metòd administrasyon altènatif sa yo.
Tout NP dezidrate yo te kenbe nan frijidè a pandan twa mwa. Rezilta SEM yo te montre ke mòfoloji tout NP dezidrate yo pa t chanje anpil pandan twa mwa depo a (Fig. 4). Apre rekonstitisyon nan dlo, tout NP yo te montre yon ti diminisyon nan EE epi yo te lage apeprè yon ti kantite (~5%) ensilin pandan peryòd depo twa mwa a (Tablo 2). Sepandan, gwosè patikil mwayèn tout nanopartikil yo te ogmante. Gwosè patikil NP ki te seche pa espre san manitol te ogmante a 525 nm, alòske gwosè patikil NP ki te seche pa espre ak friz-seche ak manitol te ogmante a 872 ak 921 nm, respektivman (Tablo 2).
Mòfoloji diferan nanopartikil ensilin dezidrate ki estoke pandan twa mwa: (a) imaj SEM nanopartikil ensilin liofilize ak mannitol; (b) imaj SEM nanopartikil ensilin seche pa espre san mannitol; (c) san mannitol imaj SEM nanopartikil ensilin seche pa espre.
Anplis de sa, yo te wè presipite nan nanopartikil ensilin rekonstitye yo ki te seche pa espre ak mannitol epi ki te seche pa frizè (Fig. S2). Sa ka koze pa gwo patikil ki pa byen sispann nan dlo a. Tout rezilta ki anwo yo demontre ke teknik siye pa espre a ka pwoteje nanopartikil ensilin yo kont dezidratasyon epi ke yo ka jwenn gwo chaj nanopartikil ensilin san okenn ranpli oswa kriyopwotektè.
Yo te teste retansyon ensilin nan yon mwayen pH = 2.5 avèk pepsin, tripsin, ak α-chimotripsin pou demontre kapasite pwoteksyon NP yo kont dijesyon anzimatik apre dezidratasyon. Yo te konpare retansyon ensilin NP dezidrate yo ak sa NP ki fèk prepare yo, epi yo te itilize ensilin lib kòm yon kontwòl negatif. Nan etid sa a, ensilin lib te montre yon eliminasyon rapid ensilin nan 4 èdtan nan tout twa tretman anzimatik yo (Fig. 5a-c). Okontrè, tès eliminasyon ensilin NP ki te konjele ak manitol ak NP ki te espre avèk oswa san manitol te montre yon pwoteksyon siyifikativman pi wo pou NP sa yo kont dijesyon anzimatik, ki te sanble ak sa NP ensilin ki fèk prepare yo (figi 1).5a-c). Avèk èd nanopartikil nan pepsin, tripsin, ak α-chimotripsin, yo te kapab pwoteje plis pase 50%, 60%, ak 75% ensilin nan 4 èdtan, respektivman (Fig. 5a-c). Pwoteksyon ensilin sa a Kapasite sa a ka ogmante chans pou yon pi gwo absòpsyon ensilin nan san an25. Rezilta sa yo sijere ke siye pa espre avèk oswa san mannitol ak siye pa konjelasyon avèk mannitol ka prezève kapasite pwoteksyon ensilin nan NP yo apre dezidratasyon.
Pwoteksyon ak konpòtman liberasyon nanopartikil ensilin dezidrate yo: (a) pwoteksyon ensilin nan solisyon pepsin; (b) pwoteksyon ensilin nan solisyon tripsin; (c) pwoteksyon ensilin pa solisyon α-chimotripsin; (d) Konpòtman liberasyon nanopartikil dezidrate yo nan solisyon pH = 2.5; (e) konpòtman liberasyon nanopartikil dezidrate yo nan solisyon pH = 6.6; (f) konpòtman liberasyon nanopartikil dezidrate yo nan solisyon pH = 7.0.
Nanopartikil ensilin sèch ki fèk prepare epi rekonstitye yo te enkube nan divès tanpon (pH = 2.5, 6.6, 7.0) a 37 °C, pou simile anviwònman pH lestomak, duodenum, ak anwo ti trip la, pou egzamine efè ensilin sou rezistans ensilin. Konpòtman liberasyon nan diferan anviwònman. Fragman nan aparèy dijestif la. Nan pH = 2.5, NP chaje ak ensilin ak NP ensilin sèk rezolibilize yo te montre yon premye liberasyon eksplozyon nan premye èdtan an, ki te swiv pa yon liberasyon dousman pandan 5 èdtan kap vini yo (Fig. 5d). Liberasyon rapid sa a nan kòmansman an gen plis chans rezilta desòpsyon sifas rapid molekil pwoteyin ki pa konplètman imobilize nan estrikti entèn patikil la. Nan pH = 6.5, NP chaje ak ensilin ak NP ensilin sèk rekonstitye yo te montre yon liberasyon lis ak dousman sou 6 èdtan, paske pH solisyon tès la te sanble ak solisyon prepare ak NP yo (Fig. 5e). Nan pH = 7, NP yo te enstab epi yo te prèske konplètman dekonpoze nan de premye èdtan yo (Fig. 5f). Sa a se paske deprotonasyon kitosan rive nan pH ki pi wo, ki lakòz yon rezo polimè mwens kontra enfòmèl ant ak liberasyon ensilin chaje.
Anplis, nanopartikil ensilin ki te seche pa espre san mannitol yo te montre yon pwofil liberasyon ki pi rapid pase lòt nanopartikil dezidrate yo (Fig. 5d-f). Jan sa te dekri deja, nanopartikil ensilin rekonstitye ki te seche san mannitol yo te montre pi piti gwosè patikil la. Ti patikil yo bay yon pi gwo sifas, kidonk pifò nan dwòg ki enpòtan an pral nan oswa toupre sifas patikil la, sa ki lakòz yon liberasyon rapid nan dwòg la26.
Yo te envestige sitotoksisite NP yo pa tès MTT. Jan yo montre nan Figi S4, yo te jwenn ke tout NP dezidrate yo pa gen okenn efè siyifikatif sou viabilité selilè nan konsantrasyon 50-500 μg/ml, sa ki sijere ke tout NP dezidrate yo ka itilize san danje pou rive nan fenèt terapetik la.
Fwa a se prensipal ògàn kote ensilin egzèse fonksyon fizyolojik li yo. Selil HepG2 yo se yon liy selil epatom imen ki souvan itilize kòm yon modèl absòpsyon epatosit in vitro. La a, yo te itilize selil HepG2 pou evalye absòpsyon selilè nanopartikil ki dezidrate lè l sèvi avèk metòd siye pa friz ak siye pa espre. Absòpsyon selilè pa eskanè lazè konfokal lè l sèvi avèk sitometri koule ak vizyon apre plizyè èdtan enkubasyon ak ensilin FITC gratis nan yon konsantrasyon 25 μg/mL, nanopartikil ki fèk prepare ak nanopartikil ki dezidrate ak ensilin FITC nan konsantrasyon ensilin egal. Yo te fè obsèvasyon mikwoskopi kantitatif (CLSM). Nanopartikil liyofilize san manitol yo te detwi pandan dezidratasyon an epi yo pa t evalye yo nan tès sa a. Entansite fliyoresans entraselulè nanopartikil ki fèk prepare ak ensilin, nanopartikil liyofilize ak manitol, ak nanopartikil ki seche pa espre ak san manitol (Fig. 6a) te 4.3, 2.6, 2.4, ak 4.1 fwa pi wo pase sa ki lib yo. Gwoup FITC-ensilin, respektivman (Fig. 6b). Rezilta sa yo sijere ke ensilin ankapsule pi puisan nan absòpsyon selilè pase ensilin lib, sitou akòz pi piti gwosè nanopartikil chaje ak ensilin ki pwodui nan etid la.
Absòpsyon selil HepG2 apre 4 èdtan enkubasyon ak NP ki fèk prepare ak NP dezidrate: (a) Distribisyon absòpsyon FITC-ensilin pa selil HepG2 yo. (b) Mwayèn jeyometrik entansite fluoresans yo analize pa sitometri koule (n = 3), *P < 0.05 konpare ak ensilin lib.
Menm jan an tou, imaj CLSM yo te montre ke entansite fliyoresans FITC nan NP ki fèk prepare ak NP ki seche pa espre ki chaje ak ensilin FITC (san manitol) te pi fò pase sa yo ki nan lòt echantiyon yo (Fig. 6a). Anplis de sa, avèk adisyon manitol la, pi gwo viskozite solisyon an te ogmante rezistans nan absòpsyon selilè, sa ki lakòz yon diminisyon nan pwopagasyon ensilin. Rezilta sa yo sijere ke NP ki seche pa espre san manitol yo te montre pi gwo efikasite absòpsyon selilè paske gwosè patikil yo te pi piti pase sa yo ki nan NP ki te konjele apre yo te fin redisolisyon.
Yo te achte kitosan (pwa molekilè mwayèn 100 KDa, 75–85% deasetile) nan men Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Yo te achte tripolifosfat sodyòm (TPP) nan men VWR (Radnor, Pennsylvania, Etazini). Ensilin imen rekombinan ki te itilize nan etid sa a te soti nan Fisher Scientific (Waltham, MA, Etazini). Yo te achte ensilin imen ki make ak fliyoresein izotiyosyanat (FITC) ak 4′,6-diamidino-2-fenilindol diidroklorid (DAPI) nan men Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Yo te jwenn liy selil HepG2 la nan men ATCC (Manassas, Virginia, Etazini). Tout lòt reyaktif yo te nan klas analitik oswa kromatografik.
Prepare yon solisyon CS 1 mg/ml lè w fonn li nan dlo distile de fwa (dlo DD) ki gen 0.1% asid asetik. Prepare solisyon 1 mg/ml TPP ak ensilin lè w fonn yo nan dlo DD ak 0.1% asid asetik, respektivman. Pre-emilsyon an te prepare ak yon omojenizatè gwo vitès polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Pwosesis preparasyon an se jan sa a: premyèman, yo ajoute 2ml solisyon TPP nan 4ml solisyon ensilin, epi yo brase melanj lan pandan 30 minit epi melanje nèt. Apre sa, yo ajoute solisyon melanje a gout pa gout nan solisyon CS la atravè yon sereng anba brase gwo vitès (10,000 rpm). Yo kenbe melanj yo anba brase gwo vitès (15,000 rpm) nan yon beny glas pandan 30 minit, epi yo te ajiste yo nan yon sèten pH pou jwenn NP ensilin ki lye kwaze. Pou plis omojenize epi redwi gwosè patikil NP ensilin yo, yo te sonike pou pou 30 minit anplis nan yon beny glas lè l sèvi avèk yon sonikatè kalite sond (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Almay).
Yo te teste NPS ensilin yo pou dyamèt mwayèn Z, endèks polidispersité (PDI) ak potansyèl zeta lè l sèvi avèk mezi difizyon limyè dinamik (DLS) avèk yon Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Otrich) lè yo te dilye yo nan dlo DD a 25°C. Yo te karakterize mòfoloji ak distribisyon gwosè ak yon mikwoskòp elektwonik transmisyon (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Japon), epi yo te analize imaj yo apre sa lè l sèvi avèk lojisyèl imaj Hitachi (Hitachi, Tokyo, Japon). Pou evalye efikasite enkapsulasyon (EE) ak kapasite chaj (LC) NP ensilin yo, yo te pipete NP yo nan tib ultrafiltrasyon ak yon limit pwa molekilè 100 kDa epi yo te santrifije yo a 500 xg pandan 30 min. Yo te kantifye ensilin ki pa ankapsule nan filtrat la lè l sèvi avèk yon sistèm HPLC Agilent Seri 1100 (Agilent, Santa Clara, Kalifòni, Etazini) ki gen ladan yon ponp kwatènè, yon otoechantiyonè, yon aparèy chofaj kolòn, ak detektè DAD. Yo te analize ensilin nan avèk yon kolòn C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) epi yo te detekte l nan 214 nm. Faz mobil lan te asetonitril ak dlo, ki gen 0.1% TFA, rapò gradyan soti nan 10/90 rive nan 100/0, epi yo te kite l fonksyone pandan 10 minit. Yo te ponpe faz mobil lan nan yon vitès koule 1.0 ml/min. Yo te fikse tanperati kolòn nan a 20 °C. Kalkile pousantaj EE ak LC yo lè l sèvi avèk ekwasyon (1) ak ekwasyon (2) yo.
Yo te teste plizyè rapò CS/ensilin ki sòti nan 2.0 a 4.0 pou optimize NP ensilin yo. Yo te ajoute diferan kantite solisyon CS pandan preparasyon an, pandan melanj ensilin/TPP a te rete konstan. Yo te prepare NP ensilin yo nan yon seri pH ant 4.0 ak 6.5 lè yo te kontwole pH melanj lan ak anpil atansyon apre yo te fin ajoute tout solisyon yo (ensilin, TPP ak CS). Yo te evalye EE ak gwosè patikil nanopartikil ensilin yo nan diferan valè pH ak rapò mas CS/ensilin pou optimize fòmasyon NP ensilin yo.
Yo te mete NP ensilin optimize yo sou veso aliminyòm nan epi yo te kouvri yo ak yon tisi sere ak tep. Apre sa, yo te mete veso vise yo nan yon seche rad konjele Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) ekipe ak yon seche rad ak plato. Yo te fikse tanperati a ak presyon vakyòm nan -10 °C, 0.350 Torr pou 2 premye èdtan yo, epi 0 °C ak 0.120 Torr pou 22 èdtan ki rete nan 24 èdtan yo pou jwenn NP ensilin sèk.
Yo te itilize Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Swis) pou jenere ensilin ankapsule. Paramèt siye yo te chwazi yo se te: tanperati 100 °C, koule manje 3 L/min, ak koule gaz 4 L/min.
Yo te karakterize nanopartikil ensilin yo anvan ak apre dezidratasyon lè l sèvi avèk espektroskopi FTIR-ATR. Yo te analize nanopartikil dezidrate yo ansanm ak ensilin lib ak kitosan lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Etazini) ekipe ak yon akseswa echantiyonaj ATR inivèsèl (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Etazini). Yo te jwenn mwayèn siyal yo nan 16 eskanè nan yon rezolisyon 4 cm2 nan seri frekans 4000-600 cm2.
Yo te evalye mòfoloji nanopartikil ensilin sèk yo grasa imaj SEM nan nanopartikil ensilin ki te seche pa frizè ak ki te seche pa espre, kaptire pa yon mikwoskòp elektwonik Helios NanoLab 650 Focused Ion-Scanning Beam-SEM (FEI, Hillsboro, Oregon, Etazini). Paramèt prensipal yo te itilize a se te vòltaj 5 keV ak kouran 30 mA.
Tout nanopartikil ensilin dezidrate yo te redisolisyone nan dlo dd. Yo te teste gwosè patikil, PDI, EE ak LC ankò lè l sèvi avèk menm metòd yo te mansyone pi bonè a pou evalye kalite yo apre dezidratasyon. Yo te mezire estabilite nanopartikil anidwoensilin yo tou lè yo te teste pwopriyete NP yo apre yon depo pwolonje. Nan etid sa a, yo te estoke tout NP yo nan frijidè a pandan twa mwa apre dezidratasyon. Apre twa mwa depo, yo te teste NP yo pou gwosè patikil mofolojik, PDI, EE ak LC.
Fonn 5 mL nanopartikil (NP) rekonstitye nan 45 mL ki gen likid gastrik similé (pH 1.2, ki gen 1% pepsin), likid entesten (pH 6.8, ki gen 1% tripsin) oswa solisyon chimotripsin (100 g/mL, nan yon tanpon fosfat, pH 7.8) pou evalye efikasite ensilin nan pwoteje NP yo apre dezidratasyon. Yo te enkube yo a 37°C ak yon vitès ajitasyon 100 rpm. Yo te kolekte 500 μL nan solisyon an nan diferan moman epi yo te detèmine konsantrasyon ensilin nan pa HPLC.
Yo te teste konpòtman liberasyon in vitro nanopartikil ensilin ki fèk prepare ak dezidrate yo avèk metòd sak dyaliz la (limit pwa molekilè 100 kDa, Spectra Por Inc.). Yo te dialize NP sèk ki fèk prepare ak rekonstitye yo nan likid ki gen pH 2.5, pH 6.6, ak pH 7.0 (0.1 M solisyon saline tampon fosfat, PBS) pou simile anviwònman pH lestomak, duodenum, ak ti trip anwo a, respektivman. Yo te enkube tout echantiyon yo a 37 °C avèk souke kontinyèl a 200 rpm. Aspire likid ki deyò sak dyaliz 5 mL la nan moman sa yo: 0.5, 1, 2, 3, 4, ak 6 èdtan, epi imedyatman ranpli volim nan ak dyalizat fre. Yo te analize kontaminasyon ensilin nan likid la pa HPLC, epi yo te kalkile to liberasyon ensilin nan nanopartikil yo apati rapò ensilin lib ki libere ak ensilin total ki ankapsule nan nanopartikil yo (Ekwasyon 3).
Selil liy selil kansè epatoselilè imen HepG2 yo te kiltive nan asyèt 60 mm dyamèt lè l sèvi avèk Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ki gen 10% serom fetal bovin, 100 IU/mL penisilin, ak 100 μg/mL streptomisin29. Kilti yo te kenbe nan 37°C, 95% imidite relatif, ak 5% CO2. Pou tès absòpsyon yo, selil HepG2 yo te simen nan 1 × 105 selil/ml sou yon sistèm lam chanm Nunc Lab-Tek 8-puits (Thermo Fisher, NY, USA). Pou tès sitotoksisite yo, yo te simen yo nan asyèt 96-puits (Corning, NY, USA) nan yon dansite 5 × 104 selil/ml.
Yo te itilize tès MTT a pou evalye sitotoksisite NP ensilin ki fèk prepare ak dezidrate30. Yo te simen selil HepG2 yo nan plak 96-pi nan yon dansite 5 × 104 selil/mL epi yo te kiltive yo pandan 7 jou anvan tès la. Yo te delye NP ensilin yo nan divès konsantrasyon (50 a 500 μg/mL) nan mwayen kilti epi answit yo te administre yo nan selil yo. Apre 24 èdtan enkubasyon, yo te lave selil yo 3 fwa ak PBS epi yo te enkube yo ak mwayen ki gen 0.5 mg/ml MTT pandan 4 èdtan anplis. Yo te evalye sitotoksisite a lè yo te mezire rediksyon anzimatik MTT tetrazolyòm jòn an formazan koulè wouj violèt nan 570 nm lè l sèvi avèk yon lektè plak espektrofotomèt Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Swis).
Yo te teste efikasite absòpsyon selilè NP yo lè yo te itilize mikwoskòp lazè konfokal ak analiz sitometri koule. Yo te trete chak pi nan sistèm lam chanm Nunc Lab-Tek la avèk ensilin FITC gratis, NP chaje ak ensilin FITC, epi yo te rekonstitye 25 μg/mL NP ensilin FITC dezidrate nan menm konsantrasyon an epi yo te enkube yo pandan 4 èdtan. Yo te lave selil yo 3 fwa avèk PBS epi yo te fikse yo avèk 4% paraformaldeyid. Yo te kolore nwayo yo avèk 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Yo te obsève lokalizasyon ensilin nan lè yo te itilize yon mikwoskòp konfokal lazè eskanè/de foton Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japon). Pou analiz sitometri koule, yo te ajoute menm konsantrasyon 10 μg/mL ensilin FITC gratis, NP chaje ak ensilin FITC, ak NP ensilin FITC dezidrate resolubilize. Yo te simen plak 96-pi yo ak selil HepG2 epi yo te enkube yo pandan 4 èdtan. Apre 4 èdtan enkubasyon, yo te retire selil yo epi lave yo 3 fwa ak FBS. Yo te analize 5 × 104 selil pou chak echantiyon ak yon sitomèt koule BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Etazini).
Tout valè yo eksprime kòm mwayèn ± devyasyon estanda. Konparezon ant tout gwoup yo te evalye lè l sèvi avèk ANOVA yon sèl chemen oswa tès t pa IBM SPSS Statistics 26 pou Mac (IBM, Endicott, New York, USA) epi p < 0.05 te konsidere kòm estatistikman siyifikatif.
Etid sa a demontre fleksibilite ak kapasite siye pa espre pou dezidrate nanopartikil kitosan/TPP/ensilin ki lye kwaze ak pi bon rekonstitisyon konpare ak metòd siye pa konjelasyon estanda ki itilize ajan ankonbran oswa kapasite kriyopwotektè ak pi gwo kapasite chaj. Nanopartikil ensilin optimize yo te bay yon gwosè patikil mwayèn 318 nm ak yon efikasite enkapsulasyon 99.4%. Rezilta SEM ak FTIR apre dezidratasyon te montre ke estrikti esferik la te konsève sèlman nan NP seche pa espre avèk ak san manitol epi liofilize ak manitol, men NP liofilize san manitol te dekonpoze pandan dezidratasyon an. Nan tès kapasite rekonstitisyon an, nanopartikil ensilin seche pa espre san manitol te montre pi piti gwosè patikil mwayèn ak pi gwo chaj lè yo te rekonstitiye. Konpòtman liberasyon tout NP dezidrate sa yo te montre ke yo te libere rapidman nan solisyon pH = 2.5 ak pH = 7, epi trè estab nan solisyon pH = 6.5. Konpare ak lòt NP dezidrate ki redisoli, NP yo Seche pa espre san manitol te montre liberasyon ki pi rapid la. Rezilta sa a konsistan avèk sa yo obsève nan tès absòpsyon selilè a, paske NP seche pa espre san manitol te prèske konplètman kenbe efikasite absòpsyon selilè NP ki fèk prepare yo. Rezilta sa yo sijere ke nanopartikil ensilin sèk ki prepare pa siye pa espre san manitol yo pi apwopriye pou plis pwosesis nan lòt fòm dòz anidrid, tankou tablèt oral oswa fim bioadezif.
Akòz pwoblèm pwopriyete entelektyèl, ansanm done yo ki te pwodui ak/oswa analize pandan etid aktyèl la pa disponib piblikman, men yo disponib nan men otè respektif yo sou yon demann rezonab.
Kagan, A. Dyabèt tip 2: orijin sosyal ak syantifik, konplikasyon medikal, ak enplikasyon pou pasyan yo ak lòt moun. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. ak Jiang, P. Devlopman enkapsulasyon ensilin: èske administrasyon oral posib kounye a? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Dènye pwogrè nan sistèm administrasyon liposòm chaje ak ensilin oral pou tretman dyabèt. Entèpretasyon. J. Famasi. 549, 201–217 (2018).