Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa sipòte CSS anpil. Pou pi bon rezilta, nou rekòmande pou w itilize yon vèsyon navigatè w ki pi resan (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, n ap montre sit la san stil oswa JavaScript.
Yo itilize asid propionik (PPA) pou etidye wòl disfonksyon mitokondriyal nan maladi newodevlopman tankou twoub spectre otis la. Li konnen PPA deranje byojenèz, metabolis, ak woulman mitokondriyal. Sepandan, efè PPA sou dinamik mitokondriyal, fisyon ak fizyon rete pwoblèmatik akòz nati tanporèl konplèks mekanis sa yo. La a, nou itilize teknik imaj kantitatif konplemantè pou envestige kijan PPA afekte ultrastrikti, mòfoloji, ak dinamik mitokondriyal nan selil SH-SY5Y ki sanble ak newòn. PPA (5 mM) te lakòz yon diminisyon siyifikatif nan zòn mitokondriyal (p < 0.01), dyamèt ak sikonferans Feret (p < 0.05), ak zòn 2 (p < 0.01). Analiz lokalizatè evènman mitokondriyal te montre yon ogmantasyon siyifikatif (p < 0.05) nan evènman fisyon ak fizyon, kidonk kenbe entegrite rezo mitokondriyal la anba kondisyon estrès. Anplis de sa, ekspresyon mRNA cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) ak OPA1 (p < 0.05) te siyifikativman redwi. 01). Sa a ilistre remodelasyon mòfoloji mitokondriyal, byojènèz ak dinamik pou kenbe fonksyon anba kondisyon estrès. Done nou yo bay nouvo insight sou efè PPA sou dinamik mitokondriyal epi mete aksan sou itilite teknik imajri pou etidye mekanis regilasyon konplèks ki enplike nan repons estrès mitokondriyal yo.
Mitokondri yo se patisipan entegral nan yon varyete fonksyon selilè ki depase wòl tipik yo nan pwodiksyon enèji ak byosentèz. Metabolis mitokondriyal la se yon regilatè kle nan siyalizasyon kalsyòm, omeyostazi metabolik ak redoks, siyalizasyon enflamatwa, modifikasyon epigenetik, pwoliferasyon selilè, diferansyasyon ak lanmò selilè pwograme1. An patikilye, metabolis mitokondriyal la enpòtan pou devlopman, siviv ak fonksyon newòn epi li lajman enplike nan divès manifestasyon neropatoloji2,3,4.
Pandan dis dènye ane yo, estati metabolik la te parèt kòm yon regilatè santral nan newwojènèz, diferansyasyon, matirasyon ak plastisite5,6. Dènyèman, mòfoloji ak dinamik mitokondriyal yo te vin tounen eleman patikilyèman enpòtan nan mitoz, yon pwosesis dinamik ki kenbe yon pisin mitokondri ki an sante nan selil yo. Dinamik mitokondriyal yo reglemante pa chemen konplèks ki entèdepandan ki sòti nan byojenèz ak byoenèji mitokondriyal rive nan fizyon, fizyon, transpò ak eliminasyon mitokondriyal7,8. Entèripsyon nenpòt nan mekanis entegratif sa yo afekte antretyen rezo mitokondriyal ki an sante epi li gen konsekans fonksyonèl pwofon pou newodevlopman9,10. Anfèt, yo obsève deregleman dinamik mitokondriyal nan anpil maladi sikyatrik, newodejeneratif ak newodevlopman, tankou maladi spectre otis (TSA)11,12.
TSA se yon maladi newodevlopman etewojèn ak yon achitekti jenetik ak epigenetik konplèks. Eritaj TSA a pa gen kontestasyon, men etioloji molekilè ki kache a rete mal konprann. Done akimilasyon ki soti nan modèl preklinik, etid klinik, ak ansanm done molekilè milti-omik bay prèv k ap ogmante sou disfonksyon mitokondriyal nan TSA13,14. Nou te deja fè yon tès depistaj metilasyon ADN sou tout jenòm nan yon gwoup pasyan ki gen TSA epi nou te idantifye jèn ki gen yon metiilasyon diferansyèl ki gwoupe sou chemen metabolik mitokondriyal yo15. Apre sa, nou te rapòte metilasyon diferansyèl regilatè santral byojenèz ak dinamik mitokondriyal yo, ki te asosye avèk yon ogmantasyon nan kantite kopi ADNmt ak yon pwofil metabolik urin ki modifye nan TSA16. Done nou yo bay prèv k ap ogmante ke dinamik mitokondriyal ak omeyostazi jwe yon wòl santral nan fizyopatoloji TSA. Se poutèt sa, amelyore konpreyansyon mekanistik relasyon ki genyen ant dinamik mitokondriyal, mòfoloji, ak fonksyon se yon objektif kle nan rechèch kontinyèl sou maladi newolojik ki karakterize pa disfonksyon mitokondriyal segondè.
Teknik molekilè yo souvan itilize pou etidye wòl jèn espesifik nan repons estrès mitokondriyal yo. Sepandan, apwòch sa a ka limite pa nati miltifasèt ak tanporèl mekanis kontwòl mitotik yo. Anplis, ekspresyon diferansyèl jèn mitokondriyal yo se yon endikatè endirèk nan chanjman fonksyonèl, sitou paske se sèlman yon kantite limite jèn ki tipikman analize. Se poutèt sa, yo te pwopoze metòd ki pi dirèk pou etidye fonksyon mitokondriyal ak byoenèji17. Mòfoloji mitokondriyal la gen yon relasyon sere avèk dinamik mitokondriyal yo. Fòm, konektivite ak estrikti mitokondriyal yo enpòtan pou pwodiksyon enèji ak siviv mitokondriyal ak selilè5,18. Anplis, divès konpozan mitoz yo konsantre sou chanjman nan mòfoloji mitokondriyal, ki ka sèvi kòm pwen final itil nan disfonksyon mitokondriyal epi bay yon baz pou etid mekanistik ki vin apre yo.
Yo ka obsève mòfoloji mitokondriyal dirèkteman lè l sèvi avèk mikwoskòp elektwonik transmisyon (TEM), sa ki pèmèt etid detaye sou ultrastrikti selilè a. TEM vizyalize dirèkteman mòfoloji, fòm ak estrikti kristal mitokondriyal yo nan rezolisyon mitokondri endividyèl yo, olye pou l konte sèlman sou transkripsyon jèn, ekspresyon pwoteyin oswa paramèt fonksyonèl mitokondriyal nan popilasyon selil yo17,19,20. Anplis de sa, TEM fasilite etid entèraksyon ant mitokondri ak lòt òganèl, tankou retikilòm andoplasmik ak otofagozòm, ki jwe wòl kle nan fonksyon mitokondriyal ak omeyostazi21,22. Kidonk, sa fè TEM yon bon pwen depa pou etidye disfonksyon mitokondriyal anvan yo konsantre sou chemen oswa jèn espesifik. Kòm fonksyon mitokondriyal vin pi enpòtan pou neropatoloji, gen yon bezwen klè pou kapab etidye dirèkteman ak kantitativman mòfoloji ak dinamik mitokondriyal nan modèl newòn in vitro.
Nan atik sa a, nou egzamine dinamik mitokondriyal nan yon modèl newòn disfonksyon mitokondriyal nan twoub spectre otis la. Nou te deja rapòte metilasyon diferansyèl propionil-CoA karboksilaz beta (PCCB) nan ASD15, yon sou-inite nan anzim karboksilaz propionil-CoA mitokondriyal PCC a. Li konnen ke disregilasyon PCC lakòz akimilasyon toksik dérivés propionil, tankou asid propionik (PPA)23,24,25. Yo te montre ke PPA deranje metabolis newòn epi modifye konpòtman in vivo epi li se yon modèl animal etabli pou etidye mekanis newodevlopman ki enplike nan ASD26,27,28. Anplis de sa, yo te rapòte ke PPA deranje potansyèl manbràn mitokondriyal, byojenèz ak respirasyon in vitro epi li te lajman itilize pou modle disfonksyon mitokondriyal nan newòn29,30. Sepandan, enpak disfonksyon mitokondriyal pwovoke pa PPA sou mòfoloji ak dinamik mitokondriyal yo rete mal konprann.
Etid sa a itilize teknik imaj konplemantè pou mezire efè PPA sou mòfoloji, dinamik, ak fonksyon mitokondri nan selil SH-SY5Y yo. Premyèman, nou te devlope yon metòd TEM pou vizyalize chanjman nan mòfoloji ak ultrastrikti mitokondri17,31,32. Etandone nati dinamik mitokondri33, nou te itilize tou analiz lokalizatè evènman mitokondri (MEL) pou mezire chanjman nan balans ant evènman fisyon ak fizyon, kantite ak volim mitokondri anba estrès PPA. Finalman, nou te egzamine si mòfoloji ak dinamik mitokondri yo asosye avèk chanjman nan ekspresyon jèn ki enplike nan byojenèz, fisyon, ak fizyon. Lè nou mete ansanm, done nou yo montre defi pou klarifye konpleksite mekanis ki reglemante dinamik mitokondri yo. Nou mete aksan sou itilite TEM nan etidye mòfoloji mitokondri kòm yon pwen final konvèjan mezirab nan mitoz nan selil SH-SY5Y yo. Anplis de sa, nou mete aksan sou ke done TEM yo bay enfòmasyon ki pi rich lè yo konbine avèk teknik imaj ki kaptire tou evènman dinamik an repons a estrès metabolik. Plis karakterizasyon sou mekanis regilasyon molekilè ki sipòte mitoz selil newòn yo ka bay plis enfòmasyon sou eleman mitokondriyal sistèm nève a ak maladi newodejeneratif yo.
Pou pwovoke estrès mitokondriyal, selil SH-SY5Y yo te trete ak PPA lè l sèvi avèk 3 mM ak 5 mM propionate sodyòm (NaP). Anvan TEM, echantiyon yo te sibi preparasyon echantiyon kriyojenik lè l sèvi avèk konjelasyon anba gwo presyon ak konjelasyon (Fig. 1a). Nou te devlope yon tiyo analiz imaj mitokondriyal otomatik pou mezire uit paramèt mòfolojik popilasyon mitokondriyal yo atravè twa replikasyon byolojik. Nou te jwenn ke tretman PPA a te chanje kat paramèt yon fason siyifikatif: zòn 2, zòn, perimèt, ak dyamèt Feret (Fig. 1b-e). Zòn 2 te diminye anpil ak tretman PPA 3 mM ak 5 mM (p = 0.0183 ak p = 0.002, respektivman) (Fig. 1b), pandan ke zòn (p = 0.003), perimèt (p = 0.0106) ak dyamèt Feret te tout diminye anpil. Te gen yon rediksyon siyifikatif (p = 0.0172) nan gwoup tretman 5 mM lan konpare ak gwoup kontwòl la (Fig. 1c-e). Rediksyon enpòtan nan sifas ak sikonferans te montre ke selil trete ak 5 mM PPA te gen mitokondri ki pi piti, pi won, epi ke mitokondri sa yo te mwens long pase sa yo ki nan selil kontwòl yo. Sa a tou konsistan avèk yon diminisyon enpòtan nan dyamèt Feret la, yon paramèt endepandan ki endike yon diminisyon nan pi gwo distans ki genyen ant bor patikil yo. Yo te obsève chanjman nan ultrastrikti krista yo: krista yo te vin mwens pwononse anba enfliyans estrès PPA a (Fig. 1a, panèl B). Sepandan, se pa tout imaj ki te reflete klèman ultrastrikti krista yo, kidonk yo pa t fè yon analiz kantitatif sou chanjman sa yo. Done TEM sa yo ka reflete twa senaryo posib: (1) PPA amelyore fizyon oswa anpeche fizyon, sa ki lakòz mitokondri ki deja egziste yo retresi nan gwosè; (2) byojenèz amelyore kreye nouvo mitokondri ki pi piti oswa (3) pwovoke tou de mekanis yo an menm tan. Malgre ke TEM pa ka distenge kondisyon sa yo, chanjman mòfolojik enpòtan endike chanjman nan omeyostazi ak dinamik mitokondri anba estrès PPA. Apre sa, nou te eksplore paramèt adisyonèl pou plis karakterize dinamik sa yo ak mekanis potansyèl ki kache dèyè yo.
Asid propionik (PPA) remodel mòfoloji mitokondriyal la. (a) Imaj reprezantatif mikwoskòp elektwonik transmisyon (TEM) ki montre ke gwosè mitokondriyal la diminye epi mitokondri yo vin pi piti epi pi awondi ak ogmantasyon tretman PPA a; 0 mM (pa trete), 3 mM ak 5 mM, respektivman. Flèch wouj yo endike mitokondri yo. (b-e) Selil SH-SY5Y trete ak PPA pandan 24 èdtan yo te prepare pou TEM epi rezilta yo te analize lè l sèvi avèk Fiji/ImageJ. Kat nan uit paramèt yo te montre diferans enpòtan ant selil kontwòl (pa trete, 0 mM PPA) ak selil trete (3 mM ak 5 mM PPA). (b) Rejyon 2, (c) Zòn, (d) Perimèt, (e) Dyamèt Feret. Analiz varyans yon sèl chemen (kontwòl vs tretman) ak tès konparezon miltip Dunnett yo te itilize pou detèmine diferans enpòtan (p < 0.05). Pwen done yo reprezante valè mitokondriyal mwayèn pou chak selil endividyèl, epi ba erè yo reprezante mwayèn ± SEM. Done yo montre yo reprezante n = 3, omwen 24 selil pa replikasyon; yo te analize yon total 266 imaj; * endike p < 0.05, ** endike p < 0.01.
Pou nou te ka plis karakterize kijan dinamik mitokondri yo reyaji a PPA, nou te kolore mitokondri yo ak tetrametilrodamin etil estè (TMRE) epi nou te itilize mikwoskòp time-lapse ak analiz MEL pou lokalize ak quantifye mitokondri yo apre 24 èdtan nan 3 ak 5 mM PPA. Tretman evènman fizyon ak fizyon. (Fig. 2a). Apre analiz MEL la, nou te analize mitokondri yo pi lwen pou quantifye kantite estrikti mitokondri yo ak volim mwayèn yo. Nou obsève yon ti ogmantasyon men siyifikatif nan kantite evènman fizyon ki rive nan 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] konpare ak fizyon [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] ak fizyon [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ak fizyon [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] te ogmante siyifikativman nan 5 mM konpare ak kontwòl la (Fig. 3b). Kantite mitokondri yo te ogmante siyifikativman nan tou de 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ak 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), pandan volim mwayèn chak estrikti mitokondriyal te rete san chanjman (Fig. 3c). 3d). Lè nou pran tout bagay sa yo ansanm, sa sijere ke remodelasyon dinamik mitokondriyal la sèvi kòm yon repons konpansatwa ki kenbe entegrite rezo mitokondriyal la avèk siksè. Ogmantasyon nan kantite evènman fizyon nan 3 mM PPA sijere ke ogmantasyon nan kantite mitokondriyal la se an pati akòz fizyon mitokondriyal, men etandone ke volim mitokondriyal mwayèn nan rete esansyèlman san chanjman, nou pa ka eskli byojènèz kòm yon repons konpansatwa adisyonèl. Sepandan, done sa yo konsistan avèk estrikti mitokondriyal ki pi piti e won yo obsève pa TEM epi yo demontre tou chanjman enpòtan nan dinamik mitokondriyal ki pwovoke pa PPA.
Asid propionik (PPA) pwovoke yon remodelasyon dinamik mitokondriyal pou kenbe entegrite rezo a. Selil SH-SY5Y yo te kiltive, trete ak 3 ak 5 mM PPA pandan 24 èdtan epi kolore ak TMRE ak Hoechst 33342, epi apre sa, yo te fè analiz MEL. (a) Imaj mikwoskopi time-lapse reprezantatif ki montre koulè ak pwojeksyon entansite maksimòm binarizé nan tan 2 (t2) pou chak kondisyon. Rejyon yo chwazi ki endike nan chak imaj binè yo amelyore epi yo parèt an 3D nan twa diferan entèval tan (t1-t3) pou ilistre dinamik yo sou tan; evènman fizyon yo make an vèt; evènman fizyon yo make an vèt. Afiche an wouj. (b) Kantite mwayèn evènman dinamik pa kondisyon. (c) Kantite mwayèn estrikti mitokondriyal pa selil. (d) Volim mwayèn (µm3) chak estrikti mitokondriyal pa selil. Done yo montre yo reprezante n = 15 selil pa gwoup tretman. Ba erè yo montre yo reprezante mwayèn ± SEM, ba echèl = 10 μm, * p < 0.05.
Asid propionik (PPA) lakòz sipresyon transkripsyonèl jèn ki asosye ak dinamik mitokondriyal yo. Selil SH-SY5Y yo te trete ak 3 ak 5 mM PPA pandan 24 èdtan. Kantifikasyon relatif jèn yo te fèt lè l sèvi avèk RT-qPCR epi yo te nòmalize yo ak B2M. Jèn byojenèz mitokondriyal (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ak (d) NFE2L2. Jèn fizyon ak fizyon mitokondriyal (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ak (i) DRP1. Diferans enpòtan (p < 0.05) yo te teste lè l sèvi avèk ANOVA yon sèl chemen (kontwòl vs tretman) ak tès konparezon miltip Dunnett a: * endike p < 0.05, ** endike p < 0.01, ak **** endike p < 0.0001. Ba yo reprezante ekspresyon mwayèn ± SEM. Done yo montre reprezante n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), ak n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) replikasyon byolojik.
Done ki soti nan analiz TEM ak MEL ansanm endike ke PPA modifye mòfoloji ak dinamik mitokondriyal yo. Sepandan, teknik imajri sa yo pa bay okenn enfòmasyon sou mekanis fondamantal ki kondwi pwosesis sa yo. Se poutèt sa, nou te egzamine ekspresyon mRNA nèf regilatè kle nan dinamik mitokondriyal, byojenèz, ak mitoz an repons a tretman PPA. Nou te quantifye onkojèn myelòm selilè (cMYC), faktè respiratwa nikleyè (NRF1), faktè transkripsyon mitokondriyal 1 (TFAM), faktè transkripsyon ki sanble ak NFE2 BZIP (NFE2L2), pwoteyin ki sanble ak gastrin 2 (STOML2), atrofi nè optik 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) ak pwoteyin ki gen rapò ak dinamin 1 (DRP1) apre 24 èdtan tretman ak 3 mM ak 5 mM PPA. Nou te obsève tretman PPA 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 ak p < 0.0001, respektivman) ak 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (Fig. 3a-c). Diminisyon nan ekspresyon mRNA a te depann de dòz la: ekspresyon cMYC, NRF1 ak TFAM te diminye pa 5.7, 2.6 ak 1.9 fwa nan 3 mM, respektivman, ak pa 11.2, 3 ak 2.2 fwa nan 5 mM. Okontrè, jèn byojenèz redoks santral NFE2L2 la pa te chanje nan okenn konsantrasyon PPA, byenke yo te obsève yon tandans menm jan an nan diminisyon ekspresyon ki depann de dòz la (Fig. 3d).
Nou te egzamine tou ekspresyon jèn klasik ki enplike nan regilasyon fisyon ak fizyon. Yo panse STOML2 enplike nan fizyon, mitofaji ak byojenèz, epi ekspresyon li te siyifikativman redwi (p < 0.0001) pa 3 mM (chanjman 2.4 fwa) ak 5 mM (chanjman 2.8 fwa) PPA (Fig. 1). 3d). Menm jan an tou, ekspresyon jèn fizyon OPA1 te diminye nan 3 mM (chanjman 1.6 fwa) ak 5 mM (chanjman 1.9 fwa) PPA (p = 0.006 ak p = 0.0024, respektivman) (Fig. 3f). Sepandan, nou pa t jwenn diferans siyifikatif nan ekspresyon jèn fizyon MFN1, MFN2 oswa jèn fizyon DRP1 anba estrès PPA 24 èdtan (Fig. 3g–i). Anplis de sa, nou te jwenn ke nivo kat pwoteyin fizyon ak fizyon (OPA1, MFN1, MFN2 ak DRP1) pa t chanje nan menm kondisyon yo (Fig. 4a-d). Li enpòtan pou note ke done sa yo reflete yon sèl pwen nan tan epi yo ka pa reflete chanjman nan ekspresyon pwoteyin oswa nivo aktivite pandan premye etap estrès PPA yo. Sepandan, rediksyon siyifikatif nan ekspresyon cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ak OPA1 endike yon deregleman transkripsyonèl siyifikatif nan metabolis mitokondriyal, byojènèz, ak dinamik. Anplis de sa, done sa yo mete aksan sou itilite teknik imajri pou etidye dirèkteman chanjman eta final nan fonksyon mitokondriyal.
Nivo pwoteyin fizyon ak faktè fizyon yo pa chanje apre tretman asid propionik (PPA). Selil SH-SY5Y yo te trete ak 3 ak 5 mM PPA pandan 24 èdtan. Nivo pwoteyin yo te quantifié pa analiz Western blot, epi nivo ekspresyon yo te nòmalize ak pwoteyin total. Ekspresyon pwoteyin mwayèn ak Western blot reprezantatif pwoteyin sib ak total yo montre. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Ba yo reprezante mwayèn ± SEM, epi done yo montre yo reprezante n = 3 replikasyon byolojik. Konparezon miltip (p < 0.05) te fèt lè l sèvi avèk analiz varyans yon sèl chemen ak tès Dunnett. Jèl orijinal la ak blot la montre nan Figi S1.
Disfonksyon mitokondriyal asosye avèk maladi miltisistèm ki sòti nan maladi metabolik, kadyovaskilè ak miskilè rive nan maladi newolojik1,10. Anpil maladi newodejeneratif ak newodejeneratif asosye avèk disfonksyon mitokondriyal, sa ki mete aksan sou enpòtans òganèl sa yo pandan tout lavi sèvo a. Maladi sa yo enkli maladi Parkinson, maladi alzayme ak TSA3,4,18. Sepandan, aksè a tisi nan sèvo pou etidye maladi sa yo difisil, sitou nan nivo mekanistik la, sa ki fè sistèm modèl selilè yo yon altènatif nesesè. Nan etid sa a, nou itilize yon sistèm modèl selilè ki itilize selil SH-SY5Y trete ak PPA pou rekapitulatif disfonksyon mitokondriyal yo obsève nan maladi newòn yo, patikilyèman twoub spectre otis la. Sèvi ak modèl PPA sa a pou etidye dinamik mitokondriyal nan newòn yo ka bay plis enfòmasyon sou etioloji TSA a.
Nou te eksplore posiblite pou itilize TEM pou wè chanjman nan mòfoloji mitokondriyal. Li enpòtan pou note ke TEM dwe itilize kòrèkteman pou maksimize efikasite li. Preparasyon kriyo-echantiyon pèmèt pi bon prezèvasyon estrikti newòn yo lè yo fikse konpozan selilè yo an menm tan epi redwi fòmasyon atifak34. An akò avèk sa, nou te obsève ke selil SH-SY5Y ki sanble ak newòn yo te gen òganèl subselilè entak ak mitokondri long (Fig. 1a). Sa a mete aksan sou itilite teknik preparasyon kriyojenik pou etidye mòfoloji mitokondriyal nan modèl selil newòn yo. Malgre ke mezi kantitatif yo enpòtan pou analiz objektif done TEM yo, toujou pa gen okenn konsansis sou ki paramèt espesifik yo ta dwe mezire pou konfime chanjman mòfolojik mitokondriyal yo. Baze sou yon gwo kantite etid ki te egzamine mòfoloji mitokondriyal kantitatif17,31,32, nou te devlope yon tiyo analiz imaj mitokondriyal otomatik ki mezire uit paramèt mòfolojik, sètadi: sifas, sifas2, rapò aspè, perimèt, sikilarite, degre, dyamèt Feret ak awondi.
Pami yo, PPA te siyifikativman redwi zòn 2, zòn, perimèt, ak dyamèt Feret (Fig. 1b-e). Sa te montre ke mitokondri yo te vin pi piti epi pi awondi, ki konsistan avèk etid anvan yo ki montre yon diminisyon nan zòn mitokondri apre 72 èdtan estrès mitokondri pwovoke pa PPA30. Karakteristik mòfolojik sa yo ka endike fizyon mitokondri, yon pwosesis nesesè pou sekestre konpozan domaje yo nan rezo mitokondri a pou ankouraje degradasyon yo atravè mitofaji35,36,37. Nan lòt men an, diminisyon nan gwosè mitokondri mwayèn nan ka asosye avèk ogmantasyon byojenèz, ki lakòz fòmasyon ti mitokondri ki fèk fèt. Ogmantasyon fizyon oswa byojenèz reprezante yon repons konpansatwa pou kenbe mitoz kont estrès mitokondri. Sepandan, diminisyon kwasans mitokondri, fizyon ki gen pwoblèm, oswa lòt kondisyon pa ka eskli.
Malgre imaj wo rezolisyon yo kreye pa TEM pèmèt detèminasyon karakteristik mòfolojik nan nivo mitokondri endividyèl yo, metòd sa a pwodui imaj bidimansyonèl nan yon sèl moman. Pou etidye repons dinamik a estrès metabolik, nou te kolore mitokondri yo ak TMRE epi nou te itilize mikwoskòp time-lapse ak analiz MEL, ki pèmèt vizyalizasyon 3D wo-debi nan chanjman nan rezo mitokondri a sou tan33,38. Nou te obsève chanjman sibtil men siyifikatif nan dinamik mitokondri anba estrès PPA (Fig. 2). Nan 3 mM, kantite evènman fizyon yo te ogmante anpil, pandan ke evènman fizyon yo te rete menm jan ak nan kontwòl la. Yo te obsève yon ogmantasyon nan kantite evènman fizyon ak fizyon nan 5 mM PPA, men chanjman sa yo te apeprè pwopòsyonèl, ki sijere ke sinetik fizyon ak fizyon rive nan ekilib nan konsantrasyon ki pi wo (Fig. 2b). Volim mitokondri mwayèn nan te rete san chanjman nan tou de 3 ak 5 mM PPA, ki endike ke entegrite rezo mitokondri a te konsève (Fig. 2d). Sa reflete kapasite rezo mitokondriyal dinamik yo pou reponn a estrès metabolik modere pou kenbe omeyostazi efektivman san yo pa lakòz fragmentasyon rezo a. Nan 3 mM PPA, ogmantasyon nan fizyon an sifi pou ankouraje tranzisyon nan yon nouvo ekilib, men yon remodelasyon sinetik ki pi pwofon nesesè an repons a estrès ki pwovoke pa pi gwo konsantrasyon PPA.
Kantite mitokondri yo te ogmante nan tou de konsantrasyon estrès PPA yo, men volim mitokondri mwayèn nan pa t chanje anpil (Fig. 2c). Sa ka akòz yon ogmantasyon nan byojenèz oswa yon ogmantasyon nan divizyon; sepandan, san yon diminisyon siyifikatif nan volim mitokondri mwayèn nan, li pi pwobab ke byosentèz la ogmante. Sepandan, done ki nan Figi 2 yo sipòte egzistans de mekanis konpansatwa: yon ogmantasyon nan kantite evènman fizyon, ki konsistan avèk ogmantasyon nan fizyon mitokondri, ak yon ogmantasyon nan kantite evènman, ki konsistan avèk byojenèz mitokondri. Anfen, konpansasyon dinamik pou estrès modere ka konsiste de pwosesis similtane ki enplike fizyon, fizyon, byojenèz, ak mitofaji. Malgre ke otè anvan yo te montre ke PPA amelyore mitoz30,39 ak mitofaji29, nou bay prèv pou remodelasyon fizyon mitokondri ak dinamik fizyon an repons a PPA. Done sa yo konfime chanjman mòfolojik yo obsève pa TEM epi bay plis enfòmasyon sou mekanis ki asosye ak disfonksyon mitokondri pwovoke pa PPA.
Piske ni analiz TEM ni analiz MEL pa t bay prèv dirèk sou mekanis regilasyon jèn ki kache dèyè chanjman mòfolojik yo obsève yo, nou te egzamine ekspresyon ARN jèn ki enplike nan metabolis mitokondriyal, byojenèz, ak dinamik. Proto-onkojèn cMYC a se yon faktè transkripsyon ki enplike nan regilasyon mitokondri, glikoliz, metabolis asid amine ak asid gra40. Anplis de sa, yo konnen cMYC kontwole ekspresyon prèske 600 jèn mitokondriyal ki enplike nan transkripsyon mitokondriyal, tradiksyon, ak asanblaj konplèks, tankou NRF1 ak TFAM41. NRF1 ak TFAM se de regilatè santral nan mitoz, ki aji an aval PGC-1α pou aktive replikasyon mtDNA. Chemen sa a aktive pa siyalizasyon cAMP ak AMPK epi li sansib a depans enèji ak estrès metabolik. Nou te egzamine tou NFE2L2, yon regilatè redoks nan byojenèz mitokondriyal, pou detèmine si efè PPA yo ta ka medyatè pa estrès oksidatif.
Malgre ekspresyon NFE2L2 a te rete san chanjman, nou te jwenn yon diminisyon konsistan nan ekspresyon cMYC, NRF1 ak TFAM ki depann de dòz la apre 24 èdtan tretman ak 3 mM ak 5 mM PPA (Fig. 3a-c). Yo te deja rapòte yon diminisyon nan ekspresyon cMYC kòm yon repons a estrès mitokondriyal42, e okontrè, diminisyon nan ekspresyon cMYC ka lakòz disfonksyon mitokondriyal lè yo remodele metabolis mitokondriyal, koneksyon rezo a, ak polarizasyon manbràn43. Sa ki enteresan, cMYC enplike tou nan règleman fizyon ak fizyon mitokondriyal42,43 epi li konnen pou ogmante fosforilasyon DRP1 ak lokalizasyon mitokondriyal pandan divizyon selilè44, epi tou pou medyatè remodele mòfolojik mitokondriyal nan selil souch newòn45. Anfèt, fibroblas ki defisyan an cMYC montre yon gwosè mitokondriyal redwi, ki konsistan avèk chanjman ki pwovoke pa estrès PPA43. Done sa yo ilistre yon relasyon enteresan men ki poko klè ant cMYC ak dinamik mitokondriyal, ki bay yon sib enteresan pou etid nan lavni sou remodele ki pwovoke pa estrès PPA.
Rediksyon NRF1 ak TFAM lan konsistan avèk wòl cMYC kòm yon aktivatè transkripsyon enpòtan. Done sa yo konsistan tou avèk etid anvan yo nan selil kansè nan kolon imen ki montre ke PPA te redwi ekspresyon mRNA NRF1 nan 22 èdtan, ki te asosye avèk rediksyon ATP ak ogmantasyon ROS46. Otè sa yo te rapòte tou ke ekspresyon TFAM te ogmante nan 8.5 èdtan men li te retounen nan nivo debaz yo nan 22 èdtan. Okontrè, Kim et al. (2019) te montre ke ekspresyon mRNA TFAM te diminye anpil apre 4 èdtan estrès PPA nan selil SH-SY5Y; sepandan, apre 72 èdtan, ekspresyon pwoteyin TFAM te ogmante anpil epi kantite kopi mtDNA te ogmante anpil. Kidonk, diminisyon nan kantite jèn byojenèz mitokondriyal ke nou te obsève apre 24 èdtan pa eskli posibilite ke ogmantasyon nan kantite mitokondri yo asosye avèk aktivasyon byojenèz nan pwen tan pi bonè. Etid anvan yo te montre ke PPA ogmante anpil mRNA ak pwoteyin PGC-1α nan selil SH-SY5Y a 4 èdtan 30 minit, alòske asid propionik amelyore byojenèz mitokondriyal nan epatosit ti bèf atravè PGC-1α a 12 èdtan 39 minit. Sa ki enteresan, PGC-1α pa sèlman yon regilatè transkripsyon dirèk nan NRF1 ak TFAM, men li te montre tou ke li kontwole aktivite MFN2 ak DRP1 lè li kontwole fisyon ak fizyon47. Lè nou mete tout ansanm, sa mete aksan sou koneksyon sere mekanis ki kontwole repons konpansatwa mitokondriyal ki pwovoke pa PPA. Anplis, done nou yo reflete disregilasyon siyifikatif nan règleman transkripsyon byojenèz ak metabolis anba estrès PPA.
Jèn STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ak DRP1 yo se pami regilatè santral fizyon, fizyon ak dinamik mitokondriyal yo37,48,49. Gen anpil lòt jèn ki enplike nan dinamik mitokondriyal yo, sepandan, yo te deja jwenn STOML2, OPA1 ak MFN2 yo metile yon fason diferan nan gwoup ASD yo,16 epi plizyè etid endepandan te rapòte chanjman nan faktè transkripsyon sa yo an repons a estrès mitokondriyal50,51.52. Ekspresyon tou de OPA1 ak STOML2 te siyifikativman redwi pa tretman PPA 3 mM ak 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 se youn nan regilatè klasik fizyon mitokondriyal yo atravè entèraksyon dirèk ak MFN1 ak 2 epi li jwe yon wòl nan remodelasyon krisèt yo ak mòfoloji mitokondriyal53. Wòl egzak STOML2 nan dinamik mitokondriyal la rete enkoni, men prèv yo sijere ke li jwe yon wòl nan fizyon mitokondriyal, byojenèz, ak mitofaji.
STOML2 enplike nan mentni kouplaj respiratwa mitokondriyal ak fòmasyon konplèks chèn respiratwa54,55 epi li te montre li chanje pwofondman karakteristik metabolik selil kansè yo56. Etid yo montre ke STOML2 ankouraje potansyèl manbràn mitokondriyal ak byojenèz atravè entèraksyon ak BAN ak kadyolipin 55, 57, 58. Anplis de sa, etid endepandan yo montre ke entèraksyon ant STOML2 ak PINK1 kontwole mitofaji59,60. Li enpòtan pou note ke STOML2 te rapòte ke li kominike dirèkteman ak MFN2 epi li estabilize li epi li jwe tou yon wòl enpòtan nan estabilizasyon izofòm OPA1 long yo lè li inibi pwoteyaz ki responsab degradasyon OPA153,61,62. Rediksyon nan ekspresyon STOML2 ki obsève nan reyaksyon PPA yo ka fè pwoteyin fizyon sa yo pi sansib a degradasyon atravè chemen ki depann de ubiquitin ak pwoteyasom48. Malgre ke wòl egzak STOML2 ak OPA1 nan repons dinamik PPA a pa klè, diminisyon ekspresyon jèn fizyon sa yo (Figi 3) ka deranje balans ki genyen ant fisyon ak fizyon epi mennen nan yon diminisyon nan gwosè mitokondri a (Figi 3). 1).
Yon lòt bò, ekspresyon pwoteyin OPA1 la te rete san chanjman apre 24 èdtan, alòske nivo mRNA ak pwoteyin MFN1, MFN2 oswa DRP1 pa t chanje anpil apre tretman PPA a (Fig. 3g-i, Fig. 4). Sa ka endike ke pa gen okenn chanjman nan règleman faktè sa yo ki enplike nan fizyon ak fizyon mitokondriyal. Sepandan, li enpòtan pou note ke chak nan kat jèn sa yo reglemante tou pa modifikasyon pòs-transkripsyonèl (PTM) ki kontwole aktivite pwoteyin. OPA1 gen uit varyant épissage altènatif ki fann pwoteyolitikman nan mitokondri pou pwodui de izofòm distenk 63. Balans ki genyen ant izofòm long ak kout yo detèmine anfen wòl OPA1 nan fizyon mitokondriyal ak antretyen rezo mitokondriyal la 64. Aktivite DRP1 la reglemante pa fosforilasyon pwoteyin kinaz II ki depann de kalsyòm/kalmodulin (CaMKII), alòske degradasyon DRP1 la reglemante pa ubikitinasyon ak SUMOylation 65. Finalman, tou de DRP1 ak MFN1/2 se GTPaz, kidonk aktivite a ka enfliyanse pa vitès pwodiksyon GTP nan mitokondri 66. Se poutèt sa, byenke ekspresyon pwoteyin sa yo rete konstan, sa ka pa reflete aktivite pwoteyin oswa lokalizasyon ki pa chanje 67,68. Anfèt, repètwa pwoteyin PTM ki deja egziste yo souvan sèvi kòm premye liy defans ki responsab pou medyasyon repons estrès egi. Nan prezans yon estrès metabolik modere nan modèl nou an, li pwobab ke PTM ankouraje yon ogmantasyon nan aktivite pwoteyin fizyon ak fizyon pou retabli entegrite mitokondri a ase san yo pa mande plis aktivasyon jèn sa yo nan nivo ARNm oswa pwoteyin.
Lè nou mete tout done ki anwo yo ansanm, yo mete aksan sou règleman konplèks mòfoloji mitokondriyal la ki depann sou tan, ansanm ak defi pou klarifye mekanis sa yo. Pou etidye ekspresyon jèn, li nesesè pou premye idantifye jèn sib espesifik nan chemen an. Sepandan, done nou yo montre ke jèn ki nan menm chemen an pa reyaji menm jan an a menm estrès la. Anfèt, etid anvan yo te montre ke diferan jèn nan menm chemen an ka montre diferan pwofil repons tanporèl30,46. Anplis de sa, gen mekanis pòs-transkripsyon konplèks ki deranje relasyon ki genyen ant transkripsyon ak fonksyon jèn. Etid pwoteyomik yo ka bay enfòmasyon sou enpak PTM yo ak fonksyon pwoteyin yo, men yo poze tou defi tankou metòd ki pa mande anpil efò, rapò siyal-bri ki wo, ak rezolisyon ki pòv.
Nan kontèks sa a, etidye mòfoloji mitokondriyal lè l sèvi avèk TEM ak MEL gen yon gwo potansyèl pou adrese kesyon fondamantal sou relasyon ki genyen ant dinamik ak fonksyon mitokondriyal ak kijan sa enfliyanse maladi. Sa ki pi enpòtan, TEM bay yon metòd dirèk pou mezire mòfoloji mitokondriyal kòm yon pwen final konvèjan nan disfonksyon ak dinamik mitokondriyal51. MEL bay tou yon metòd dirèk pou vizyalize evènman fizyon ak fizyon nan yon anviwònman selilè twa dimansyon, sa ki pèmèt kantifikasyon remodelasyon dinamik mitokondriyal menm nan absans chanjman nan ekspresyon jèn33. Isit la nou mete aksan sou itilite teknik imaj mitokondriyal nan maladi mitokondriyal segondè yo. Maladi sa yo tipikman karakterize pa estrès metabolik kwonik modere ki karakterize pa remodelasyon sibtil nan rezo mitokondriyal olye ke domaj mitokondriyal egi. Sepandan, konpansasyon mitokondriyal ki nesesè pou kenbe mitoz anba estrès kwonik gen konsekans fonksyonèl pwofon. Nan kontèks newosyans, yon pi bon konpreyansyon sou mekanis konpansatwa sa yo ka bay enfòmasyon enpòtan sou neropatoloji pleyotropik ki asosye ak disfonksyon mitokondriyal.
Finalman, done nou yo mete aksan sou itilite teknik imajri pou konprann konsekans fonksyonèl entèraksyon konplèks ant ekspresyon jèn, modifikasyon pwoteyin, ak aktivite pwoteyin ki kontwole dinamik mitokondriyal newòn yo. Nou te itilize PPA pou modle disfonksyon mitokondriyal nan yon modèl selil newòn pou nou te ka konprann konpozan mitokondriyal ASD a. Selil SH-SY5Y trete ak PPA te montre chanjman nan mòfoloji mitokondriyal: mitokondri yo te vin piti epi won, epi krista yo te mal defini lè yo te obsève yo pa TEM. Analiz MEL montre ke chanjman sa yo rive ansanm ak yon ogmantasyon nan evènman fizyon ak fizyon pou kenbe rezo mitokondriyal la an repons a yon estrès metabolik modere. Anplis de sa, PPA deranje anpil règleman transkripsyonèl metabolis mitokondriyal ak omeyostazi. Nou te idantifye cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ak OPA1 kòm regilatè mitokondriyal kle ki deranje pa estrès PPA epi ki ka jwe yon wòl nan medyasyon chanjman pwovoke pa PPA nan mòfoloji ak fonksyon mitokondriyal. Etid nan lavni nesesè pou pi byen karakterize chanjman tanporèl pwovoke pa PPA nan ekspresyon jèn ak aktivite pwoteyin, lokalizasyon, ak modifikasyon pòs-tradiksyon. Done nou yo mete aksan sou konpleksite ak entèdepandans mekanis regilasyon ki medyatè repons estrès mitokondriyal la epi demontre itilite TEM ak lòt teknik imajri pou etid mekanistik ki pi siblé.
Yo te achte liy selil SH-SY5Y la (ECACC, 94030304-1VL) nan men Sigma-Aldrich. Yo te kiltive selil SH-SY5Y yo nan melanj Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 nutrient mix (DMEM/F-12) ak L-glutamin (SC09411, ScienCell) nan flakon 25 cm2 ki te gen 20% seròm fetal bovin (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ak 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) nan 37 °C, 5% CO2. Yo te kiltive selil yo nan yon nivo konflyans 80% lè l sèvi avèk 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), yo te santrifije yo nan 300 g epi yo te plake yo nan yon dansite apeprè 7 × 105 selil/ml. Tout eksperyans yo te fèt sou selil SH-SY5Y endiferansye ant pasaj 19 ak 22. Yo administre PPA kòm NaP. Fonn poud NaP (CAS No. 137-40-6, fòmil chimik C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) nan dlo tyèd MilliQ jiska yon konsantrasyon 1 M epi estoke a 4 °C. Nan jou tretman an, delye solisyon sa a ak 1 M PPA jiska 3 mM ak 5 mM PPA nan yon medyòm san serom (DMEM/F-12 ak L-glutamin). Konsantrasyon tretman pou tout eksperyans yo te pa gen PPA (0 mM, kontwòl), 3 mM, ak 5 mM PPA. Eksperyans yo te fèt nan omwen twa replikasyon byolojik.
Selil SH-SY5Y yo te simen nan flakon 25 cm5 nan yon vitès 5.5 × 105 selil/ml epi yo te kiltive pandan 24 èdtan. Tretman PPA a te ajoute nan flakon an anvan 24 èdtan enkubasyon. Kolekte grenn selil yo swivan pwotokòl subkilti tisi mamifè nòmal yo (ki dekri anwo a). Resispann grenn selil la nan 100 µl 2.5% glutaraldeyid, 1× PBS epi estoke a 4 °C jiskaske tretman an. Selil SH-SY5Y yo te santrifije yon ti tan pou fè grenn selil yo epi retire solisyon 2.5% glutaraldeyid, 1× PBS. Resispann sediman an nan yon jèl agaroz 4% prepare nan dlo distile (rapò agaroz ak volim sediman an se 1:1). Moso agaroz yo te mete sou griy sou plak plat epi kouvri ak 1-egzadekèn anvan konjelasyon anba gwo presyon. Echantiyon yo te konjele nan 100% asetòn sèk a -90°C pandan 24 èdtan. Apre sa, yo te ogmante tanperati a rive nan -80°C epi yo te ajoute yon solisyon 1% tetroksid osmiyòm ak 0.1% glutaraldeyid. Yo te estoke echantiyon yo nan -80°C pandan 24 èdtan. Apre sa, yo te ogmante tanperati a piti piti rive nan tanperati chanm pandan plizyè jou: soti nan – 80 °C rive nan – 50 °C pandan 24 èdtan, rive nan – 30 °C pandan 24 èdtan, rive nan – 10 °C pandan 24 èdtan epi finalman rive nan tanperati chanm.
Apre preparasyon kriyojenik la, echantiyon yo te enpreye ak résine epi yo te fè seksyon ultra mens (apeprè 100 nm) lè l sèvi avèk yon ultramikrotòm ​​Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Seksyon yo te kolore ak 2% asetat uranil ak sitrat plon. Echantiyon yo te obsève lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elektwonik transmisyon FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (ansyen FEI), Eindhoven, Peyi Ba) k ap opere a 200 kV (transmetè Lab6) ak yon kamera CCD Gatan (Gatan, UK) ekipe ak yon filtè enèji Tridiem.
Nan chak replikasyon teknik, yo te pran omwen 24 imaj selil endividyèl, pou yon total 266 imaj. Yo te analize tout imaj yo lè l sèvi avèk makro Rejyon Enterè (ROI) ak makro Mitokondri a. Makro mitokondri a baze sou metòd pibliye17,31,32 epi li pèmèt tretman pakèt semi-otomatik imaj TEM nan Fiji/ImageJ69. An brèf: yo envèse imaj la epi yo ranvèse l lè l sèvi avèk soustraksyon background boul woule (reyon 60 pixel) ak yon filtè bandpass FFT (lè l sèvi avèk limit siperyè ak enferyè 60 ak 8 pixel respektivman) ak sipresyon liy vètikal ak yon tolerans oryantasyon 5%. Yo otomatikman limite imaj ki trete a lè l sèvi avèk yon algorithm entropi maksimòm epi yo pwodui yon mask binè. Yo te ekstrè rejyon imaj ki asosye avèk ROI yo chwazi manyèlman nan imaj TEM kri yo, pou karakterize mitokondri yo epi eskli manbràn plasma a ak lòt rejyon ki gen gwo kontras. Pou chak ROI ki te ekstrè, yo te analize patikil binè ki pi gwo pase 600 piksèl, epi yo te mezire sifas patikil la, perimèt, aks majè ak minè, dyamèt Feret, awondi, ak sikilarite lè l sèvi avèk fonksyon mezi entegre Fiji/ImageJ yo. Swivan Merrill, Flippo, ak Strack (2017), yo te kalkile sifas 2, rapò aspè patikil la (rapò aks majè ak minè), ak faktè fòm (FF) apati done sa yo, kote FF = perimèt 2/4pi x sifas. Ou ka jwenn definisyon fòmil parametrik la nan Merrill, Flippo, ak Strack (2017). Makro yo mansyone yo disponib sou GitHub (gade Deklarasyon Disponibilite Done). An mwayèn, yo te analize apeprè 5,600 patikil pou chak tretman PPA, pou yon total apeprè 17,000 patikil (done yo pa montre).
Selil SH-SH5Y yo te mete nan asyèt kilti 8 chanm (ThermoFisher, #155411) pou pèmèt adezyon pandan tout lannwit lan epi answit yo te enkube ak TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ak Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Yo te pran imaj yo lè l sèvi avèk lazè 405 nm ak 561 nm sou yon anviwònman 10 minit, epi yo te pran imaj brit yo kòm z-stacks ki gen 10 mikwo-graf imaj ak yon entèval az de 0.2 μm ant ankadreman imaj yo nan 12 pwen tan ki vin apre. Yo te kolekte imaj yo lè l sèvi avèk yon platfòm super-rezolisyon Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Almay) lè l sèvi avèk yon lantiy LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Yo te analize imaj yo nan ImageJ lè l sèvi avèk yon tiyo ki te dekri deja ak plugin ImageJ la pou mezire evènman fizyon ak fizyon, kantite mwayèn estrikti mitokondriyal, ak volim mitokondriyal mwayèn pa selil33. Makro MEL yo disponib sou GitHub (gade Deklarasyon Disponibilite Done).
Selil SH-SY5Y yo te kiltive nan plak sis pi nan yon dansite 0.3 × 106 selil/mL pandan 24 èdtan anvan tretman an. ARN te ekstrè lè l sèvi avèk pwotokòl Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) avèk ti modifikasyon: ajoute 300 μl tanpon liziz ARN nan chak pi anvan yo retire li epi lize chak echantiyon kòm yon dènye etap avèk 30 μl elisyon DNase/RNase. dlo san. Tout echantiyon yo te tcheke pou kantite ak kalite lè l sèvi avèk yon NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Pwoteyin total ki soti nan lizat selilè yo te jwenn lè l sèvi avèk 200 μl tanpon liziz RIPA, epi konsantrasyon pwoteyin nan te quantifye lè l sèvi avèk tès pwoteyin Bradford70 la.
Yo te fè sentèz ADNc a lè l sèvi avèk Twous Sentèz ADNc Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) dapre enstriksyon manifakti a avèk kèk modifikasyon. Yo te sentetize ADNc nan reyaksyon 20-μl lè l sèvi avèk 0.7 a 1 μg ARN total. Yo te chwazi primè yo nan atik ki te pibliye deja 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tablo S1) epi yo te desine sond ki akonpaye yo lè l sèvi avèk zouti PrimerQuest ki soti nan Integrated DNA Technologies. Yo te nòmalize tout jèn ki enterese yo anrapò ak jèn nikleyè B2M lan. Yo te mezire ekspresyon jèn STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ak OPA1 pa RT-qPCR. Melanj prensipal la te gen ladan l LUNA Taq polimeraz (M3003L, New England Biolabs), 10 μM primè pou pi devan ak pou pi dèyè, ADNc, ak dlo klas PCR pou bay yon volim final 10 μL pou chak reyaksyon. Ekspresyon jèn divizyon ak fizyon (DRP1, MFN1/2) te mezire lè l sèvi avèk tès miltiplex TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) te itilize dapre enstriksyon manifakti a avèk ti modifikasyon. Melanj prensipal RT-qPCR miltiplex la gen ladan l 1X LUNA Taq polimeraz, 10 μM primè pou pi devan ak pou pi dèyè, 10 μM sond, ADNc, ak dlo klas PCR, sa ki bay yon volim final 20 μL pou chak reyaksyon. RT-qPCR te fèt lè l sèvi avèk Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nimewo seri: R0618110). Kondisyon siklaj yo montre nan Tablo S1. Tout echantiyon ADNc yo te anplifye an triplika epi yo te pwodui yon koub estanda lè l sèvi avèk yon seri dilisyon dis fwa. Yo te retire nan analiz la valè aberan nan echantiyon triplika ki gen devyasyon estanda papòt sik (Ct) >0.5 pou asire repwodiktibilite done yo30,72. Yo te kalkile ekspresyon jèn relatif la lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCt79 la.
Echantiyon pwoteyin yo (60 μg) te melanje ak yon tanpon chajman Laemmli nan yon rapò 2:1 epi yo te pase yo sou yon jèl pwoteyin san koulè 12% (Bio-Rad #1610184). Pwoteyin yo te transfere nan yon manbràn PVDF (polivinilidèn fliyò) (#170-84156, Bio-Rad) lè l sèvi avèk sistèm Trans-Blot Turbo a (#170-4155, Bio-Rad). Manbràn nan te bloke epi enkube ak antikò prensipal ki apwopriye yo (OPA1, MFN1, MFN2, ak DRP1) (dilye 1:1000) pandan 48 èdtan, epi apre sa, yo te enkube l ak antikò segondè (1:10,000) pandan 1 èdtan. Apre sa, yo te pran imaj manbràn yo lè l sèvi avèk Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) epi yo te anrejistre yo lè l sèvi avèk yon sistèm Bio-Rad ChemiDoc MP. Yo te itilize ImageLab vèsyon 6.1 pou analiz Western blot. Jèl orijinal la ak blot la parèt nan Figi S1. Enfòmasyon sou antikò yo bay nan Tablo S2.
Ansanm done yo prezante kòm mwayèn ak erè estanda mwayèn nan (SEM) omwen twa echantiyon endepandan. Yo te teste ansanm done yo pou nòmalite lè l sèvi avèk tès Shapiro-Wilks la (sof si yo endike otreman) anvan yo te sipoze yon distribisyon Gaussienne ak devyasyon estanda egal epi kontinye ak analiz yo. Anplis analiz ansanm done yo lè l sèvi avèk Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ANOVA yon sèl chemen (mwayèn tretman vs. kontwòl), ak tès konparezon miltip Dunnett a pou detèmine siyifikasyon (p < 0.05). Valè p siyifikatif yo montre nan graf la kòm *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Tout analiz estatistik ak graf yo te fèt epi pwodui lè l sèvi avèk GraphPad Prism 9.4.0.
Makro Fiji/ImageJ pou analiz imaj TEM yo disponib piblikman sou GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) la disponib piblikman sou GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ak Vijaya A. Mitokondri: regilatè prensipal metabolis, omeyostazi, estrès, vyeyisman ak epigenetik. Endonezyen. Syans byomedikal. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfonksyon mitokondriyal miltifasèt nan eskizofreni, konplèks I kòm yon posib sib patolojik. Eskizofreni. resous. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. ak Beal, MF Disfonksyon mitokondriyal nan maladi Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ak Mehta V. Mitokondri estrèse: sib envazyon nan maladi alzaymè a. Mitokondri 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF ak Ferreira GK Mitokondri ak sèvo a: byoenèji ak plis ankò. Neyrotoksin. resous. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondri pleyotropik: enpak mitokondri sou devlopman newòn ak maladi. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. ak Morais, VA Byojenèz mitokondriyal nan newòn: kijan ak ki kote. Entènasyonalite. J. Mohr. Syans lan. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. ak Zhao, J. Règleman dinamik mitokondriyal mamifè yo: opòtinite ak defi. front. andokrin. (Lozan) 11, 374 (2020).
Khacho, M. ak Slack, RS Dinamik mitokondriyal nan regilasyon newwojènèz: soti nan sèvo an devlopman rive nan sèvo adilt. devlopman. dinamik. 247, 47–53 (2018).