*Adrès aktyèl: Cologne 50931, Almay, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Repons in Aging-related Diseases (CECAD).
Neurodejenerasyon maladi mitokondriyal yo konsidere kòm irevokabl paske plastisite metabolik newòn yo limite, men efè disfonksyon mitokondriyal la sou otonomi selilè metabolis newòn nan kò a pa byen konprann. La a, nou prezante pwoteyòm espesifik selil newòn Purkinje yo ak defisyans OXPHOS pwogresif ki koze pa dinamik fizyon mitokondriyal ki deranje. Nou te jwenn ke disfonksyon mitokondriyal la te deklanche yon chanjman pwofon nan domèn pwoteyomik la, ki finalman te mennen nan aktivasyon sekansyèl pwogram metabolik presi anvan lanmò selilè. Sanzatann, nou te detèmine endiksyon evidan karboksilaz piruvat (PCx) ak lòt anzim anti-vyeyisman ki konplete entèmedyè sik TCA a. Inibisyon PCx te agrave estrès oksidatif ak neurodejenerasyon, sa ki endike ke ateroskleroz gen yon efè pwoteksyon nan newòn ki manke OXPHOS. Restorasyon fizyon mitokondriyal nan newòn ki dejenere nan fen an ranvèse konplètman karakteristik metabolik sa yo, kidonk anpeche lanmò selilè. Rezilta nou yo idantifye chemen ki pa t konnen anvan ki konfere rezistans a disfonksyon mitokondriyal epi montre ke neurodejenerasyon ka ranvèse menm nan etap avanse maladi a.
Wòl santral mitokondri yo nan mentni metabolis enèji newòn lan mete aksan sou li pa sentòm newolojik vaste ki asosye ak maladi mitokondriyal imen yo. Pifò nan maladi sa yo koze pa mitasyon jèn ki kontwole ekspresyon jèn mitokondriyal (1, 2) oswa destriksyon jèn ki gen rapò ak dinamik mitokondriyal, ki afekte endirèkteman estabilite ADN mitokondriyal (mtDNA) (3, 4). Travay nan modèl bèt yo montre ke an repons a disfonksyon mitokondriyal nan tisi ki antoure yo, chemen metabolik konsèvatif (5-7) ka aktive, ki bay enfòmasyon enpòtan pou yon konpreyansyon apwofondi sou patogenez maladi konplèks sa yo. Okontrè, konpreyansyon nou sou chanjman metabolik kalite selil espesifik ki koze pa echèk jeneral pwodiksyon adenozin trifosfat (ATP) mitokondriyal nan sèvo a fondamantal (8), sa ki mete aksan sou nesesite pou idantifye sib terapetik ki ka itilize pou anpeche oswa anpeche maladi. Anpeche newodejenerasyon (9). Mank enfòmasyon an se lefèt ke selil nè yo lajman konsidere kòm gen yon fleksibilite metabolik trè limite konpare ak kalite selil tisi ki antoure yo (10). Etandone selil sa yo jwe yon wòl santral nan kowòdinasyon ekipman pou metabolit nan newòn yo pou ankouraje transmisyon sinaptik epi reponn a kondisyon blesi ak maladi, kapasite pou adapte metabolis selilè a kondisyon difisil tisi nan sèvo a prèske limite a selil glial yo (11-14). Anplis de sa, eterogeneite selilè natirèl tisi nan sèvo a anpeche anpil etid chanjman metabolik ki rive nan sougwoup newòn espesifik. Kòm rezilta, yo pa konnen anpil bagay sou konsekans selilè ak metabolik egzak disfonksyon mitokondriyal nan newòn yo.
Pou nou te ka konprann konsekans metabolik disfonksyon mitokondriyal yo, nou te izole newòn Purkinje (PN) nan diferan etap neurodejenerasyon ki koze pa destriksyon fizyon manbràn ekstèn mitokondriyal la (Mfn2). Malgre ke mitasyon Mfn2 nan moun yo asosye avèk yon fòm neropati sansoryèl motè erityè ke yo rekonèt kòm Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15), destriksyon kondisyonèl Mfn2 nan sourit se yon metòd disfonksyon fosforilasyon oksidasyon (OXPHOS) byen rekonèt. Diferan soutip newòn yo (16-19) ak fenotip neurodejeneratif ki soti a akonpaye pa sentòm newolojik pwogresif, tankou twoub mouvman (18, 19) oswa ataksi serebeleuz (16). Lè nou itilize yon konbinezon pwoteyomik kantitatif san etikèt (LFQ), metabolomik, imajri, ak metòd virolojik, nou montre ke neurodejenerasyon pwogresif pwovoke fòtman karboksilaz piruvat (PCx) ak lòt faktè ki enplike nan ateryoskleroz PN yo in vivo. Ekspresyon anzim yo. Pou verifye enpòtans dekouvèt sa a, nou te espesyalman diminye ekspresyon PCx nan PN ki defisyan nan Mfn2, epi nou te jwenn ke operasyon sa a te agrave estrès oksidatif la epi akselere newodejenerasyon an, kidonk pwouve ke azospermi konfere lanmò selilè. Ekspresyon MFN2 grav ka sove nèt dejenerasyon tèminal PN a ak defisyans OXPHOS grav, konsomasyon masiv ADN mitokondriyal, ak rezo mitokondriyal aparamman kase, ki plis mete aksan sou ke fòm newodejenerasyon sa a ka menm refè nan etap avanse maladi a anvan lanmò selilè.
Pou nou te kapab vizyalize mitokondri yo nan PN ki te sibi modifikasyon Mfn2 (Mfn2 knockout), nou te itilize yon souch sourit ki pèmèt mitokondri ki depann de Cre yo vize pwoteyin fliyoresan jòn (YFP) (mtYFP) (20) ekspresyon Cre epi nou te verifye mòfoloji mitokondriyal la in vivo. Nou te jwenn ke destriksyon jèn Mfn2 nan PN yo ta mennen nan divizyon gradyèl rezo mitokondriyal la (Figi S1A), epi premye chanjman an te jwenn nan laj 3 semèn. Okontrè, gwo dejenerasyon kouch selil PN a, jan pèt imunokolorasyon Calbindin lan montre sa, pa t kòmanse jiskaske laj 12 semèn (Figi 1, A ak B). Dezekilib tan ki genyen ant premye chanjman yo nan mòfoloji mitokondriyal la ak aparisyon vizib lanmò newòn nan te pouse nou envestige chanjman metabolik yo deklanche pa disfonksyon mitokondriyal anvan lanmò selilè. Nou te devlope yon estrateji ki baze sou klasman selil aktive pa fliyoresans (FACS) pou izole PN ki eksprime YFP (YFP+) (Figi 1C), ak nan sourit kontwòl (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ke nou pral rele CTRL apre sa (Figi S1B). Optimizasyon estrateji pòtay la ki baze sou entansite relatif siyal YFP a pèmèt nou pirifye kò YFP+ (YFPhigh) PN yo soti nan non-PN (YFPneg) (Figi S1B) oswa swadizan fragman akson/dendritik fliyoresans (YFPlow; Figi S1D, agoch), konfime pa mikwoskòp konfokal (Figi S1D, adwat). Pou verifye idantite popilasyon klase a, nou te fè pwoteyomik LFQ epi answit analiz konpozan prensipal yo, epi nou te jwenn ke gen yon separasyon klè ant selil YFPhigh ak YFPneg yo (Figi S1C). Selil YFPhigh yo te montre yon anrichisman nèt nan makè PN li te ye yo (tankou Calb1, Pcp2, Grid2 ak Itpr3) (21, 22), men pa gen okenn anrichisman nan pwoteyin ki eksprime souvan nan newòn oswa lòt kalite selil (Figi 1D)). Yon konparezon ant echantiyon nan selil YFPhigh klase yo kolekte nan eksperyans endepandan te montre yon koyefisyan korelasyon > 0.9, ki demontre bon repwodiktibilite ant replikasyon byolojik yo (Figi S1E). An rezime, done sa yo valide plan nou an pou izolasyon egi ak espesifik nan PN posib. Paske sistèm chofè L7-cre ki itilize a pwovoke rekombinasyon mozayik nan premye semèn apre akouchman an (23), nou te kòmanse elimine sourit yo nan CTRL ak kondisyonèl (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Koleksyon newòn yo. Apre rekombinasyon an fini, yo rele li Mfn2cKO a laj 4 semèn. Kòm pwen final la, nou te chwazi laj 8 semèn lè kouch PN a te entak malgre fragmentasyon mitokondriyal evidan an (Figi 1B ak Figi S1A). Antou, nou te kantifye yon total de 3013 pwoteyin, pami yo anviwon 22% te baze sou anotasyon MitoCarta 2.0 ki baze sou pwoteyòm mitokondriyal la kòm mitokondri (Figi 1E) (Figi 1E) (24). Analiz ekspresyon jèn diferansyèl ki te fèt nan semèn 8 la te montre ke sèlman 10.5% nan tout pwoteyin yo te gen chanjman siyifikatif (Figi 1F ak Figi S1F), pami yo 195 pwoteyin te anba-reglemante ak 120 pwoteyin te anwo-reglemante (Figi 1F). Li enpòtan pou note ke "analiz chemen inovatè" nan seri done sa a montre ke jèn ki eksprime diferansyèlman yo sitou fè pati yon seri chemen metabolik espesifik ki limite (Figi 1G). Sa ki enteresan, byenke anba-regleman chemen ki gen rapò ak OXPHOS ak siyalizasyon kalsyòm konfime endiksyon disfonksyon mitokondriyal nan PN ki defisyan fizyon, lòt kategori ki sitou enplike metabolis asid amine yo siyifikativman anwo-reglemante, ki an liy ak metabolis ki rive nan PN mitokondriyal yo. Rekableaj la konsistan.
(A) Foto konfokal reprezantatif seksyon serebeleuz sourit CTRL ak Mfn2cKO ki montre pèt pwogresif PN yo (kalbindin, gri); nwayo yo te kont-kolorye ak DAPI. (B) Kantifikasyon (A) (analiz varyans yon sèl chemen, ***P<0.001; n = 4 a 6 sèk ki soti nan twa sourit). (C) Pwosesis travay eksperimantal. (D) Distribisyon kat chalè makè espesifik pou Purkinje (anlè) ak lòt kalite selil (nan mitan). (E) Dyagram Venn ki montre kantite pwoteyin mitokondriyal idantifye nan PN klase a. (F) Tras vòlkan pwoteyin ki eksprime diferansyèlman nan newòn Mfn2cKO yo nan 8 semèn (valè papòt siyifikasyon 1.3). (G) Analiz chemen kreyativite a montre senk chemen ki pi enpòtan pou ogmantasyon (wouj) ak diminisyon (ble) nan PN Mfn2cKO klase kòm 8 semèn. Nivo ekspresyon mwayèn chak pwoteyin detekte a montre. Kat chalè gri: valè P ajiste. ns, pa enpòtan.
Done pwoteyomik yo te montre ke ekspresyon pwoteyin konplèks I, III, ak IV yo te diminye piti piti. Konplèks I, III, ak IV yo tout te genyen sou-inite esansyèl kode pa mtDNA, alòske konplèks II, ki te sèlman kode nikleyè, te fondamantalman pa afekte (Figi 2A ak Figi S2A). . An akò avèk rezilta pwoteyomik yo, imunoistochimik seksyon tisi serebeleuz yo te montre ke nivo sou-inite MTCO1 (mitokondriyal sitokrom C oksidaz sou-inite 1) nan konplèks IV nan PN te diminye piti piti (Figi 2B). Sou-inite Mtatp8 kode pa mtDNA a te siyifikativman redwi (Figi S2A), alòske nivo eta estab sou-inite ATP sentaz kode nikleyè a te rete san chanjman, ki konsistan avèk konplèks sou-asanblaj ATP sentaz F1 ki estab lè ekspresyon mtDNA a estab. Fòmasyon an konsistan. Entèripsyon (7). Evalyasyon nivo ADNmt nan PN Mfn2cKO klase yo pa reyaksyon chèn polimeraz an tan reyèl (qPCR) te konfime diminisyon gradyèl nan kantite kopi ADNmt. Konpare ak gwoup kontwòl la, a laj 8 semèn, se sèlman anviwon 20% nan nivo ADNmt ki te rete (Figi 2C). An akò avèk rezilta sa yo, yo te itilize koloran mikwoskopi konfokal PN Mfn2cKO yo pou detekte ADN, ki montre konsomasyon nikleyotid mitokondriyal yo ki depann de tan (Figi 2D). Nou te jwenn ke se sèlman kèk kandida ki enplike nan degradasyon pwoteyin mitokondriyal ak repons estrès ki te ogmante, tankou Lonp1, Afg3l2 ak Clpx, ak faktè asanblaj konplèks OXPHOS. Pa gen okenn chanjman enpòtan nan nivo pwoteyin ki enplike nan apoptoz ki te detekte (Figi S2B). Menm jan an tou, nou te jwenn ke chanèl mitokondri ak retikulum andoplasmik ki enplike nan transpò kalsyòm yo gen sèlman ti chanjman (Figi S2C). Anplis de sa, evalyasyon pwoteyin ki gen rapò ak otofaji yo pa jwenn okenn chanjman enpòtan, sa ki konsistan avèk endiksyon vizib otofagozòm yo obsève in vivo pa imunoistochimik ak mikwoskòp elektwonik (Figi S3). Sepandan, disfonksyon OXPHOS pwogresif nan PN yo akonpaye pa chanjman mitokondriyal ultra estriktirèl evidan. Gwoupman mitokondriyal yo ka wè nan kò selilè yo ak pyebwa dendritik PN Mfn2cKO ki gen laj 5 ak 8 semèn, epi estrikti manbràn entèn lan te sibi gwo chanjman (Figi S4, A ak B). An akò avèk chanjman ultra estriktirèl sa yo ak yon diminisyon siyifikatif nan mtDNA, analiz tranch serebeleuz serebral egi ak tetrametilrodamin metil estè (TMRM) te montre ke potansyèl manbràn mitokondriyal nan PN Mfn2cKO yo te diminye siyifikativman (Figi S4C).
(A) Analiz tanporèl nivo ekspresyon konplèks OXPHOS la. Konsidere sèlman pwoteyin ki gen P<0.05 nan 8 semèn (ANOVA de-fason). Liy pwentiye: Pa gen ajisteman konpare ak CTRL. (B) Agoch: Yon egzanp yon seksyon serebeleu ki make ak antikò anti-MTCO1 (ba echèl, 20 μm). Zòn ki okipe pa kò selil Purkinje yo kouvri ak jòn. Adwat: Kantifikasyon nivo MTCO1 yo (analiz varyans yon sèl chemen; n = 7 a 20 selil analize nan twa sourit). (C) Analiz qPCR sou kantite kopi ADNmt nan PN klase a (analiz varyans yon sèl chemen; n = 3 a 7 sourit). (D) Agoch: Yon egzanp yon tranch serebeleu ki make ak yon antikò anti-ADN (ba echèl, 20 μm). Zòn ki okipe pa kò selil Purkinje yo kouvri ak jòn. Adwat: Kantifikasyon lezyon ADNmt (analiz varyans yon sèl chemen; n = 5 a 9 selil nan twa sourit). (E) Yon egzanp yon seksyon serebeleu egi ki montre selil mitoYFP + Purkinje (flèch) nan yon anrejistreman patch clamp selil antye. (F) Kantifikasyon koub IV la. (G) Anrejistreman reprezantatif enjeksyon kouran depolarizan nan selil Purkinje CTRL ak Mfn2cKO. Tras anwo: Premye pulsasyon ki te deklanche AP. Tras anba: Frekans maksimòm AP. (H) Kantifikasyon antre espontane postsinaptik (sPSP). Tras anrejistreman reprezantatif la ak rapò zoom li yo montre nan (I). Analiz varyans yon sèl sans analize n = 5 a 20 selil ki soti nan twa sourit. Done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM; *P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001. (J) Tras reprezantatif AP espontane anrejistre lè l sèvi avèk mòd patch clamp pèfore a. Tras anwo: Frekans maksimòm AP. Tras anba: zoom yon sèl AP. (K) Kantifye frekans mwayèn ak maksimòm AP a dapre (J). Tès Mann-Whitney; n = 5 selil yo te analize nan kat sourit. Done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM; pa enpòtan.
Yo te detekte yon domaj OXPHOS evidan nan newòn Mfn2cKO ki gen 8 semèn nan, sa ki endike ke fonksyon fizyolojik newòn yo gravman anormal. Se poutèt sa, nou te analize karakteristik elektrik pasif newòn ki defisyan OXPHOS yo nan 4 a 5 semèn ak 7 a 8 semèn lè nou te fè anrejistreman patch clamp selil antye nan tranch serebeleuz egi (Figi 2E). Sanzatann, potansyèl mwayèn manbràn repo a ak rezistans antre newòn Mfn2cKO yo te sanble ak kontwòl la, byenke te gen diferans sibtil ant selil yo (Tablo 1). Menm jan an tou, nan laj 4 a 5 semèn, yo pa jwenn okenn chanjman siyifikatif nan relasyon kouran-vòltaj la (koub IV) (Figi 2F). Sepandan, pa gen okenn newòn Mfn2cKO ki gen 7 a 8 semèn ki te siviv rejim IV la (etap ipèpolarizasyon), sa ki endike ke gen yon sansiblite klè a potansyèl ipèpolarizasyon nan etap reta sa a. Okontrè, nan newòn Mfn2cKO yo, kouran depolarizan ki lakòz egzeyat potansyèl aksyon repetitif (PA) yo byen tolere, sa ki endike ke modèl egzeyat jeneral yo pa siyifikativman diferan de sa yo ki nan newòn kontwòl ki gen 8 semèn (Tablo 1 ak Figi 2G). Menm jan an tou, frekans ak anplitid kouran postsinaptik espontane (sPSC) yo te konparab ak sa yo ki nan gwoup kontwòl la, epi frekans evènman yo te ogmante soti nan 4 semèn a 5 semèn a 7 semèn a 8 semèn ak yon ogmantasyon menm jan an (Figi 2, H ak I). Peryòd matirite sinaptik nan PN yo (25). Rezilta menm jan an te jwenn apre plak PN ki pèfore yo. Konfigirasyon sa a anpeche posib konpansasyon domaj ATP selilè yo, jan sa ta ka rive nan anrejistreman kranpon patch selil antye. An patikilye, potansyèl manbràn repo a ak frekans egzeyat espontane newòn Mfn2cKO yo pa te afekte (Figi 2, J ak K). An rezime, rezilta sa yo endike ke PN ki gen malfonksyon OXPHOS evidan ka byen fè fas ak modèl egzeyat wo frekans, sa ki endike ke gen yon mekanis konpansasyon ki pèmèt yo kenbe repons elektwofizyolojik prèske nòmal.
Done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM (analiz varyans yon sèl chemen, tès konparezon miltip Holm-Sidak la; *P<0.05). Nimewo inite a endike pa parantèz.
Nou te vle mennen ankèt pou nou wè si gen nenpòt kategori nan seri done pwoteyomik la (Figi 1G) ki gen ladan chemen ki ka konbat defisyans OXPHOS grav, kidonk eksplike poukisa PN ki afekte a ka kenbe yon elektwofizyoloji prèske nòmal (Figi 2, E rive K). Analiz pwoteyomik la te montre ke anzim ki enplike nan katabolis asid amine chèn branche (BCAA) yo te siyifikativman ogmante (Figi 3A ak Figi S5A), epi pwodui final la asetil-CoA (CoA) oswa suksinil CoA ka konplete trikarboksilat yo nan sik asid ateroskleroz (TCA). Nou te jwenn ke kontni BCAA transaminaz 1 (BCAT1) ak BCAT2 tou de ogmante. Yo katalize premye etap katabolis BCAA a lè yo jenere glutamat soti nan α-ketoglutarat (26). Tout sou-inite ki fòme konplèks keto asid dezidrogenaz chèn branche (BCKD) la ogmante (konplèks la katalize dekarboksilasyon ki vin apre a ak irevokabl nan skelèt kabòn BCAA ki kapab lakòz la) (Figi 3A ak Figi S5A). Sepandan, pa gen okenn chanjman evidan nan BCAA li menm ki te jwenn nan PN klase yo, ki ka akòz ogmantasyon absòpsyon selilè nan asid amine esansyèl sa yo oswa itilizasyon lòt sous (glikoz oswa asid laktik) pou konplete sik TCA a (Figi S5B). PN ki pa gen OXPHOS yo te montre tou yon ogmantasyon nan aktivite dekonpozisyon ak transaminasyon glutamin a laj 8 semèn, ki ka reflete pa ogmantasyon anzim mitokondriyal glutaminaz (GLS) ak glutamin piruvat transaminaz 2 (GPT2) (Figi 3, A ak C). Li enpòtan pou note ke ogmantasyon GLS la limite a izofòm glutaminaz C épissé (GLS-GAC) (chanjman Mfn2cKO/CTRL la apeprè 4.5 fwa pi gwo, P = 0.05), epi ogmantasyon espesifik li nan tisi kansè yo ka sipòte bioenèji mitokondriyal. (27)
(A) Kat chalè a montre chanjman nan nivo pwoteyin pou wout espesifye a nan 8 semèn. (B) Egzanp yon tranch serebeleu ki make ak antikò anti-PCx (ba echèl, 20 μm). Flèch jòn nan montre kò selil Purkinje a. (C) Analiz ekspresyon pwoteyin sou kou tan idantifye kòm yon kandida enpòtan pou ateroskleroz (tès t miltip, *FDR <5%; n = 3-5 sourit). (D) Anwo: Yon dyagram eskematik ki montre diferan fason pou antre nan kabòn ki make ki genyen nan trasè [1-13C]piruvat la (sa vle di, atravè wout PDH oswa trans-ateryèl). Anba: Tablo vyolon an montre pousantaj kabòn ki make yon sèl fwa (M1) ki konvèti an asid aspartik, asid sitrik ak asid malik apre yo fin make tranch serebeleu egi yo ak [1-13C]piruvat (tès t pè; ** P <0.01). (E) Analiz konplè sou istwa tan nan chemen ki endike a. Konsidere sèlman pwoteyin ki gen P<0.05 nan 8 semèn. Liy tire: pa gen valè ajisteman (analiz varyans bidireksyonèl; * P <0.05; *** P <0.001). Done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM.
Nan analiz nou an, katabolis BCAA a vin tounen youn nan chemen prensipal pou ogmantasyon nan tansyon. Reyalite sa a sijere fòtman ke volim vantilasyon ki antre nan sik TCA a ka chanje nan PN ki pa gen OXPHOS. Sa ka reprezante yon fòm enpòtan nan rekable metabolik newòn, ki ka gen yon enpak dirèk sou fizyoloji newòn ak siviv pandan mentni yon disfonksyon OXPHOS grav. An akò avèk ipotèz sa a, nou te jwenn ke prensipal anzim anti-aterosklerotik PCx la ogmante (Mfn2cKO/CTRL chanje apeprè 1.5 fwa; Figi 3A), ki katalize konvèsyon piruvat an oksaloacetat (28), ke yo kwè ki nan tisi nan sèvo. Ekspresyon an limite a astrosit (29, 30). An akò avèk rezilta pwoteyomik yo, mikwoskopi konfokal te montre ke ekspresyon PCx te ogmante espesyalman ak siyifikativman nan PN ki pa gen OXPHOS, pandan ke reyaktivite PCx te sitou limite a selil glial Bergmann adjasan nan kontwòl la (Figi 3B). Pou nou teste fonksyonèlman ogmantasyon PCx ki te obsève a, nou te trete tranch serebeleu egi yo ak trasè [1-13C]piruvat. Lè piruvat te okside pa piruvat dezidrogenaz (PDH), etikèt izotòp li a te disparèt, men li enkòpore nan entèmedyè sik TCA yo lè piruvat metabolize pa reyaksyon vaskilè (Figi 3D). Pou sipòte done pwoteyomik nou yo, nou te obsève yon gwo kantite makè ki soti nan trasè sa a nan asid aspartik tranch Mfn2cKO yo, pandan ke asid sitrik ak asid malik te gen yon tandans modere tou, byenke pa siyifikatif (Figi 3D).
Nan newòn dopamine sourit MitoPark ki gen disfonksyon mitokondriyal ki koze pa newòn dopamine ki detwi espesyalman jèn faktè transkripsyon mitokondriyal A (Tfam) (Figi S6B), ekspresyon PCx te ogmante tou anpil (31), sa ki endike ke maladi a reglemante pandan disfonksyon OXPHOS newòn nan kò a. Li enpòtan pou note ke yo te jwenn ke anzim inik (32-34) ki ka eksprime nan newòn ki ka asosye avèk ateryoskleroz yo ogmante anpil nan PN ki manke OXPHOS, tankou karboksilaz propionil-CoA (PCC-A), Malonil-CoA konvèti propionil-CoA an suksinil-CoA ak anzim malik mitokondriyal 3 (ME3), ki gen wòl prensipal li se rekipere piruvat nan malat (Figi 3, A ak C) (33, 35). Anplis de sa, nou te jwenn yon ogmantasyon siyifikatif nan anzim Pdk3 la, ki fosforile e konsa dezaktive PDH (36), alòske pa gen okenn chanjman ki te detekte nan anzim Pdp1 ki aktive PDH la oswa konplèks anzim PDH la li menm (Figi 3A). Konsistanman, nan PN Mern2cKO yo, fosforilasyon sou-inite α1 α (PDHE1α) sou-inite nan konpozan piruvat dezidrogenaz E1 nan konplèks PDH la nan Ser293 (ke yo konnen ki anpeche aktivite anzim PDH la) te ogmante (Figi S6C) (Figi S6C). Piruvat pa gen aksè vaskilè.
Finalman, nou te jwenn ke sipè chemen byosentèz serin ak glisin lan, sik folat mitokondriyal (1C) ki gen rapò ak li a ak byosentèz prolin lan (Figi 1G ak Figi S5C) yo tout ogmante anpil, dapre rapò yo, pandan pwosesis aktivasyon an. Tisi ki antoure yo aktive ak disfonksyon mitokondriyal (5-7). Analiz konfokal ki sipòte done pwoteyomik sa yo te montre ke nan PN ak OXPHOS ki manke, tranch serebeleu sourit ki gen 8 semèn yo te sibi serin idroksimetiltransferaz 2 (SHMT2), yon anzim kle nan sik folat mitokondriyal la. Repons iminitè siyifikatif (Figi S5D). Nan 13 tranch serebeleu egi ki te enkube ak CU-glikoz, eksperyans trasaj metabolik yo te konfime plis ogmantasyon byosentèz serin ak prolin lan, ki endike ke flux izofòm kabòn nan serin ak prolin ogmante (Figi S5E). Piske reyaksyon GLS ak GPT2 ankouraje yo responsab pou sentèz glutamat soti nan glutamin ak transaminasyon ant glutamat ak α-ketoglutarat, ogmantasyon yo endike ke newòn ki defisyan OXPHOS yo gen yon demann ogmante pou glutamat, Sa ka vize pou kenbe ogmantasyon byosentèz prolin lan (Figi S5C). Kontrèman ak chanjman sa yo, yon analiz pwoteyomik astrosit serebeleuz ki soti nan sourit Mfn2cKO espesifik pou PN te montre ke chemen sa yo (ki gen ladan tout antiperoksidaz) pa t chanje anpil nan ekspresyon, kidonk demontre ke redireksyon metabolik sa a selektif pou PN degrade (Fig. S6, D rive G).
An rezime, analiz sa yo te revele modèl aktivasyon tanporèl chemen metabolik espesifik nan PN yo ki siyifikativman diferan. Malgre ke fonksyon mitokondriyal newòn anòmal ka mennen nan ateroskleroz bonè ak remodelasyon 1C (Figi 3E ak Figi S5C), e menm chanjman previzib nan ekspresyon konplèks I ak IV yo, chanjman nan sentèz serin de novo yo sèlman vin aparan nan etap avanse yo. Disfonksyon OXPHOS (Figi 3E ak Figi S5C). Rezilta sa yo defini yon pwosesis sekansyèl kote mitokondriyal (sik 1C) ak sitoplasmik (byosentèz serin) pwovoke pa estrès la reponn sinèrjikman ak ogmantasyon ateroskleroz nan sik TCA a pou transfòme metabolis newòn.
PN ki gen 8 semèn ki defisyan nan OXPHOS ka kenbe aktivite eksitasyon wo frekans epi sibi rekoneksyon metabolik siyifikatif pou konpanse pou malfonksyon mitokondriyal la. Dekouvèt sa a soulve yon posibilite enteresan ke menm nan moman sa a, selil sa yo ka resevwa tou entèvansyon terapetik pou retade oswa anpeche newodejenerasyon. Anreta. Nou te rezoud posibilite sa a atravè de entèvansyon endepandan. Nan premye metòd la, nou te desine yon vektè viris adeno-asosye (AAV) ki depann de Cre pou MFN2 ka eksprime selektivman nan PN ki defisyan nan OXPHOS in vivo (Figi S7A). AAV ki kode MFN2 a ak jèn rapòtè fliyoresan mCherry (Mfn2-AAV) yo te verifye nan kilti newòn prensipal in vitro, sa ki te lakòz MFN2 eksprime nan yon fason ki depann de Cre epi sove mòfoloji mitokondriyal la, kidonk anpeche newomitasyon nan newòn Mfn2cKO (Figi S7, B, D ak E). Apre sa, nou te fè eksperyans in vivo pou nou te delivre Mfn2-AAV ki gen 8 semèn nan kòtèks serebeleuz sourit Mfn2cKO ak sourit kontwòl yo, epi nou te analize sourit ki gen 12 semèn (Figi 4A). Sourit Mfn2cKO ki te trete yo te mouri (Figi 1, A ak B) (16). Transdiksyon viral in vivo te lakòz yon ekspresyon selektif PN nan kèk sèk serebeleuz (Figi S7, G ak H). Enjeksyon AAV kontwòl la ki te eksprime sèlman mCherry (Ctrl-AAV) pa t gen okenn efè siyifikatif sou degre newodejenerasyon nan bèt Mfn2cKO yo. Okontrè, analiz Mfn2cKO yo ki te transdi ak Mfn2-AAV te montre yon efè pwoteksyon siyifikatif nan kouch selil PN an (Figi 4, B ak C). An patikilye, dansite newòn nan sanble prèske endistibl ak bèt kontwòl yo (Figi 4, B ak C, ak Figi S7, H ak I). Ekspresyon MFN1 men pa MFN2 egalman efikas nan sove lanmò newòn (Figi 4C ak Figi S7, C ak F), ki endike ke ekspresyon MFN1 ektopik la ka efektivman konplete mank MFN2. Pli lwen analiz nan nivo PN sèl la te montre ke Mfn2-AAV te lajman sove ultrastrikti mitokondri yo, nòmalize nivo mtDNA yo, epi ranvèse gwo ekspresyon makè anti-anjyojenèz PCx ​​la (Figi 4, C rive E). Enspeksyon vizyèl sourit Mfn2cKO sove yo nan yon eta repo te montre ke pwèstans ak sentòm motè yo (mouvman S1 rive S3) te amelyore. An konklizyon, eksperyans sa yo montre ke reentwodiksyon MFN2 reta nan PN ki gen yon gwo defisyans nan OXPHOS sifi pou ranvèse konsomasyon mtDNA epi pwovoke ateroskleroz, kidonk anpeche dejenerasyon akson ak lanmò newòn in vivo.
(A) Yon chema ki montre orè eksperimantal pou enjekte AAV ki kode MFN2 lè chemen metabolik endike a aktive. (B) Imaj konfokal reprezantatif tranch serebeleu ki gen 12 semèn ki te transdisyone a 8 semèn nan sourit Mfn2cKO epi ki make ak antikò anti-Calbindin. Adwat: Echèl fib akson yo. Echèl zoom akson an se 450 ak 75 μm. (C) Agoch: Kantifikasyon dansite selil Purkinje nan bouk transdiksyon AAV (AAV+) (analiz varyans yon sèl chemen; n = 3 sourit). Adwat: analiz konsantre mtDNA nan PN transdisyone nan semèn 12 (tès t ki pa pè; n = 6 selil ki soti nan twa sourit). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikwograf elektwonik transmisyon reprezantatif PN seksyon serebeleu Mfn2cKO ki te transdisyone ak vektè viral endike yo. Mask woz la montre zòn dendrit yo okipe a, epi kare jòn pwentiye a montre zoom ki sou bò dwat la; n reprezante nwayo a. Ba echèl, 1μm. (E) montre yon egzanp koloran PCx nan PN transdisyone a 12 semèn. Ba echèl, 20μm. OE, surekspresyon; FC, chanjman pli.
Finalman, nou te envestige enpòtans siviv selilè pwovoke pa peroksidaz nan PN ki te fè eksperyans disfonksyon OXPHOS. Nou te pwodui mCherry ki kode AAV-shRNA (short hairpin RNA) espesyalman vize mRNA PCx sourit (AAV-shPCx), epi nou te enjekte viris la oswa kontwòl melanje li (AAV-scr) nan serebelo sourit Mfn2cKO yo. Enjeksyon an te fèt nan katriyèm semèn laj la (Figi 5A) pou reyalize yon rediksyon PCx efikas pandan peryòd lè ekspresyon PCx la te ogmante (Figi 3C) epi kouch selil PN lan te toujou entak (Figi 1A). Li enpòtan pou note ke rediksyon PCx (Figi S8A) mennen nan yon akselerasyon siyifikatif nan lanmò PN, ki limite a bag enfekte a (Figi 5, B ak C). Pou nou te ka konprann mekanis efè metabolik ki pwovoke pa ogmantasyon PCx la, nou te etidye estati redoks PN yo apre yo te fin retire PCx la epi yo te eksprime an menm tan byosantè optik Grx1-roGFP2 ki te medyatè pa AAV (Figi S8, B rive D) pou evalye chanjman relatif potansyèl redoks peptid glutatyon an (38). Apre sa, nou te fè mikwoskopi imaj fluoresans de foton pou tout lavi (FLIM) nan tranch sèvo egi nan Mfn2cKO ki gen 7 semèn oswa nan menm nivo ak lòt moun pou detekte chanjman potansyèl nan estati redoks sitoplasmik la apre nou te fin verifye kondisyon FLIM yo (Figi S8, E rive G). Analiz la te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan eta oksidasyon yon sèl PN Mfn2cKO ki pa gen ekspresyon PCx, ki diferan de newòn kontwòl yo oswa PN Mfn2cKO ki eksprime sèlman shRNA melanje (Figi 5, D ak E). Lè yo te diminye ekspresyon PCx la, pousantaj PN Mfn2cKO ki montre yon eta trè oksidize ogmante plis pase twa fwa (Figi 5E), sa ki endike ke ogmantasyon PCx la te kenbe kapasite redoks newòn dejenere yo.
(A) Yon chema ki montre orè eksperimantal pou enjekte AAV ki kode shPCx lè chemen metabolik ki endike a aktive. (B) Foto konfokal reprezantatif seksyon serebeleuz ki gen 8 semèn nan sourit Mfn2cKO ki te transdi epi make ak antikò anti-kalsineurin nan 4 semèn. Ba echèl, 450μm. (C) Kantifikasyon dansite selil Purkinje nan bouk transdi ak AAV (analiz varyans yon sèl chemen; n = 3 a 4 sourit). Done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM; ***P <0.001. (D) Imaj FLIM reprezantatif la montre dire lavi mwayèn yon detèktè redoks glutatyon Grx1-roGFP2 ki eksprime PN ki gen 7 semèn anba kondisyon eksperimantal espesifye yo. Rapò LUT (tablo rechèch): entèval tan siviv (an pikosegond). Ba echèl, 25μm. (E) Istogram nan montre distribisyon valè dire lavi Grx1-roGFP2 yo soti nan (D) (n=158 a 368 selil nan de sourit anba chak kondisyon). Grafik sikilè ki anlè chak istogram nan montre kantite selil ki gen valè dire lavi ki pi long (wouj, oksidize) oswa pi kout (ble, redwi), ki depase 1 SD nan valè dire lavi mwayèn nan CTRL-AAV-scr. (F) Modèl pwopoze a montre efè pwoteksyon ogmantasyon PCx newòn lan.
An jeneral, done nou bay yo montre ke re-ekspresyon MFN2 ka sove nèt PN avanse ki gen yon defisyans OXPHOS grav, yon rediksyon mtDNA grav, ak yon mòfoloji ki sanble ak ista ki trè anòmal, kidonk sa bay yon pwogrè kontinyèl menm nan maladi avanse. Neyodejenerasyon bay prèv revèsib sou etap anvan lanmò selilè a. Degre fleksibilite metabolik sa a vin pi enpòtan toujou grasa kapasite newòn yo pou pwovoke ateroskleroz (yon rekable sik TCA a), ki inibi ekspresyon PCx nan PN ki pa gen OXPHOS epi ki amelyore lanmò selilè, kidonk sa jwe yon wòl pwoteksyon (Figi 5F).
Nan etid sa a, nou te bay prèv ki montre repons newòn pulmonè (PN) yo a disfonksyon OXPHOS la se pou yo piti piti konvèje nan ateroskleroz sik TCA a atravè chemen aktivasyon diferansyèl ki aktive pa pwogram metabolik yo. Nou te konfime analiz pwoteyomik la ak plizyè metòd konplemantè epi nou te revele ke lè yo sibi yon disfonksyon mitokondriyal grav, newòn yo gen yon fòm elastisite metabolik ki pa t konnen anvan. Pou sipriz nou, tout pwosesis rekable a pa nesesèman make eta metabolik tèminal ki akonpaye newodejenerasyon an piti piti e irevokablman, men done nou yo sijere ke li ka konstitye yon newòn antretyen menm nan etap anvan lanmò selilè a. Mekanis konpansasyon fonksyonèl. Rezilta sa a endike ke newòn yo gen yon degre konsiderab nan plastisite metabolik nan kò a. Reyalite sa a pwouve ke reentwodiksyon MFN2 pita a ka ranvèse ekspresyon makè metabolik kle yo epi anpeche dejenerasyon PN. Okontrè, li inibi ateroskleroz epi li akselere nè transseksyèl yo.
Youn nan dekouvèt ki pi kaptivan nan rechèch nou an se ke PN ki pa gen OXPHOS ka modifye metabolis sik TCA a lè yo ogmante anzim ki espesyalman estimile ateroskleroz. Rearanjman metabolik se yon karakteristik komen nan selil kansè yo, kèk ladan yo konte sou glutamin pou konplete entèmedyè sik TCA yo pou pwodui ekivalan reduktè, ki kondwi chèn respiratwa a epi kenbe pwodiksyon prekisè byosentèz lipid ak nikleotid (39, 40). Yon etid resan te montre ke nan tisi periferik ki gen disfonksyon OXPHOS, rekoneksyon metabolis glutamin/glutamat se yon karakteristik enpòtan tou (5, 41), kote direksyon antre glutamin nan sik TCA a depann de Akòz gravite blesi OXPHOS la (41). Sepandan, pa gen ase prèv klè sou nenpòt resanblans nan plastisite metabolik newòn nan kò a ak posib enpòtans li nan kontèks maladi a. Nan yon etid in vitro resan, yo te montre ke newòn kortikal prensipal yo mobilize pisin glutamat pou newotransmisyon, kidonk ankouraje metabolis oksidatif ak ateroskleroz anba kondisyon estrès metabolik (42). Li enpòtan pou note ke anba inibisyon famakolojik anzim sik TCA a, sikinat deidrojenaz, yo kwè karboksilasyon piruvat kenbe sentèz oksaloacetat nan newòn granul serebeleuz kiltive (34). Sepandan, enpòtans fizyolojik mekanis sa yo pou tisi nan sèvo (kote yo kwè ateroskleroz la sitou limite a astrosit) toujou gen yon siyifikasyon fizyolojik enpòtan (43). Nan ka sa a, done nou yo montre ke PN ki domaje pa OXPHOS nan kò a ka chanje an degradasyon BCAA ak karboksilasyon piruvat, ki se de sous prensipal sipleman entèmedyè pisin TCA yo. Malgre ke yo te pwopoze kontribisyon swadizan katabolis BCAA nan metabolis enèji newòn, anplis wòl glutamat ak GABA pou newotransmisyon (44), toujou pa gen okenn prèv pou mekanis sa yo in vivo. Se poutèt sa, li fasil pou espekile ke PN disfonksyonèl yo ka otomatikman konpanse pou konsomasyon entèmedyè TCA ki kondwi pa pwosesis asimilasyon an lè yo ogmante ateroskleroz. An patikilye, yon ogmantasyon PCx ka nesesè pou kenbe yon demann ogmante pou asid aspartik, sa ki sijere nan selil pwoliferasyon ki gen disfonksyon mitokondriyal (45). Sepandan, analiz metabolomik nou an pa revele okenn chanjman enpòtan nan nivo asid aspartik nan eta fiks nan PN Mfn2cKO yo (Figi S6A), ki prezimableman reflete diferan itilizasyon metabolik asid aspartik ant selil pwoliferasyon yo ak newòn pòs-mitotik yo. Malgre ke mekanis egzak ogmantasyon PCx nan newòn disfonksyonèl in vivo a rete pou karakterize, nou demontre ke repons twò bonè sa a jwe yon wòl enpòtan nan kenbe eta redoks newòn yo, sa ki te demontre nan eksperyans FLIM sou tranch serebeleuz yo. An patikilye, anpeche PN yo ogmante PCx ka mennen nan yon eta plis oksidize epi akselere lanmò selilè. Aktivasyon degradasyon BCAA ak karboksilasyon piruvat la pa fason pou karakterize tisi periferik ki gen disfonksyon mitokondriyal (7). Se poutèt sa, yo sanble yon karakteristik priyorite nan newòn ki defisyan nan OXPHOS, menm si se pa sèl karakteristik la, ki enpòtan pou newodejenerasyon. .
Maladi serebeleu a se yon kalite maladi newodejeneratif etewojèn ki anjeneral manifeste kòm ataksi epi souvan domaje PN yo (46). Popilasyon newòn sa a patikilyèman vilnerab a disfonksyon mitokondriyal paske dejenerasyon selektif yo nan sourit yo ase pou repwodui anpil nan sentòm motè ki karakterize ataksi spinoserebeleu imen an (16, 47, 48). Dapre rapò yo, yon modèl sourit transjenik ak yon jèn mutan asosye avèk ataksi spinoserebeleu imen an epi li gen disfonksyon mitokondriyal (49, 50), sa ki mete aksan sou enpòtans pou etidye konsekans defisyans OXPHOS nan PNPH. Se poutèt sa, li patikilyèman apwopriye pou izole ak etidye popilasyon newòn inik sa a efektivman. Sepandan, etandone ke PN yo trè sansib a presyon epi yo reprezante yon ti pwopòsyon nan tout popilasyon selil serebeleu a, pou anpil etid ki baze sou omik, separasyon selektif yo kòm selil antye toujou yon aspè difisil. Malgre ke li prèske enposib pou reyalize yon absans absoli kontaminasyon lòt kalite selil (sitou tisi adilt), nou konbine yon etap disosyasyon efikas ak FACS pou jwenn yon kantite sifizan newòn ki ka viv pou analiz pwoteyomik an aval, epi nou gen yon pwoteksyon pwoteyin ki wo anpil (anviwon 3000 pwoteyin) konpare ak seri done ki deja egziste sou tout serebelo a (51). Lè nou prezève viabilité selil antye yo, metòd nou bay la a pèmèt nou non sèlman tcheke chanjman nan chemen metabolik yo nan mitokondri yo, men tou tcheke chanjman nan tokay sitoplasmik li yo, ki konplete itilizasyon etikèt manbràn mitokondri pou anrichi kalite selil la. Nouvo metòd la pou kantite mitokondri nan tisi konplèks yo (52, 53). Metòd nou dekri a pa sèlman gen rapò ak etid selil Purkinje yo, men li ka fasil pou aplike nan nenpòt kalite selil pou adrese chanjman metabolik nan sèvo malad, tankou lòt modèl disfonksyon mitokondri.
Finalman, nou idantifye yon fenèt terapetik pandan pwosesis rearanjman metabolik sa a ki ka ranvèse nèt siy kle estrès selilè yo epi anpeche dejenerasyon newòn. Se poutèt sa, konprann enplikasyon fonksyonèl re-kableaj ki dekri isit la ka bay enfòmasyon fondamantal sou tretman posib pou kenbe viabilité newòn pandan disfonksyon mitokondriyal. Rechèch nan lavni ki vize pou analize chanjman nan metabolis enèji nan lòt kalite selil nan sèvo nesesè pou revele nèt aplikabilite prensip sa a nan lòt maladi newolojik.
Yo te deja dekri sourit MitoPark yo (31). Yo te deja dekri sourit C57BL/6N ki gen jèn Mfn2 flanke pa loxP (18) epi yo te kwaze yo ak sourit L7-Cre (23). Desandan doub etewozigòt ki te sòti yo te kwaze ak sourit omozigòt Mfn2loxP/Mfn2loxP pou jenere jèn Purkinje-espesifik knockout pou Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Nan yon sou-gwoup kwazman, yo te entwodui alèl Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) atravè kwazman adisyonèl (20). Tout pwosedi sou bèt yo te fèt an akò ak direktiv Ewopeyen yo, nasyonal yo ak enstitisyonèl yo epi yo te apwouve pa LandesamtfürNatur nan Umwelt ak Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Almay. Travay sou bèt yo swiv tou direktiv Federasyon Ewopeyen Asosyasyon Syans Animal Laboratwa yo.
Apre yo fin anestezye dislokasyon sèvikal fanm ansent lan, yo izole anbriyon sourit la (E13). Yo te disseke korteks la nan Solisyon Sale Balanse Hanks (HBSS) complété ak 10 mM Hepes epi yo te pase l sou Dulbecco's Modified Eagle's Medium ki gen papain (20 U/ml) ak cysteine ​​(1μg/ml). Enkube tisi a nan DMEM) epi disosye li pa dijesyon anzimatik. Ml) a 37°C pandan 20 minit, epi answit yo te moulen li mekanikman nan DMEM complété ak 10% seròm fetal bovin. Yo te simen selil yo sou kouvèti an vè kouvri ak polilizin nan yon dansite 2×106 pou chak plat kilti 6 cm oswa nan yon dansite 0.5×105 selil/cm2 pou analiz imaj. Apre 4 èdtan, yo te ranplase medyòm nan ak medyòm san seròm Neurobasal ki gen 1% sipleman B27 ak 0.5 mM GlutaMax. Apre sa, yo te kenbe newòn yo nan 37°C ak 5% CO2 pandan tout eksperyans lan, epi yo te ba yo manje yon fwa pa semèn. Pou pwovoke rekombinasyon in vitro, yo te itilize 3μl (plak kilti 24-pi) oswa 0.5μl (plak 24-pi) nan vektè viris AAV9 sa a pou trete newòn yo nan dezyèm jou a in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nimewo katalòg 105530-AAV9) ak AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nimewo katalòg 105545-AAV9).
ADN konplemantè sourit Mfn1 ak Mfn2 (yo jwenn nan plasmid Addgene #23212 ak #23213, respektivman) make ak sekans V5 la (GKPINPLLGLDST) nan C-tèminal la, epi yo fizyone ak mCherry nan kad atravè sekans T2A a. Grx1-roGFP2 se yon kado ki soti nan Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Lè yo ranplase kasèt tdTomato a lè l sèvi avèk metòd klonaj konvansyonèl yo, kasèt la te sou-klone nan baz pAAV-CAG-FLEX-tdTomato a (nimewo referans Addgene 28306) pou jenere vektè pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ak pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Yo te itilize yon estrateji sanblab pou jenere vektè kontwòl pAAV-CAG-FLEX-mCherry a. Pou jenere konstriksyon AAV-shPCx la, yo bezwen yon vektè plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), ki gen sekans ADN ki kode shRNA ki vize PCx sourit la (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Anba kontwòl pwomotè U6 la, yo itilize mCherry anba kontwòl pwomotè CMV la. Yo te pwodui vektè AAV oksilyè yo dapre enstriksyon manifakti a (Cell Biolabs). An brèf, sèvi ak yon plasmid transfè ki pote mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) tanporèman pou transfeksyon jèn kodaj selil 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) oswa Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), ansanm ak kodaj pwoteyin kapsid AAV1 ak pwoteyin akseswa plasmid anbalaj, lè l sèvi avèk metòd fosfat kalsyòm. Yo te jwenn sipènatant viris brit la pa sik konjele-dekonjele nan yon beny glas sèk/etanòl epi yo te lize selil yo nan saline tampon fosfat (PBS). Vektè AAV la te pirifye pa ultrasantrifijasyon gradyan iodiksanòl diskontinyèl (24 èdtan a 32,000 rpm ak 4°C) epi konsantre lè l sèvi avèk yon filtè santrifij Amicon ultra-15. Tit jenòm AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopi jenòm (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX te jan sa te dekri deja (54), mezire pa PCR kantitatif an tan reyèl (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ak AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Yo te grate newòn prensipal yo nan PBS 1x ki frèt tankou glas, yo te mete yo nan yon grenn, epi answit yo te omojeneize yo nan yon tanpon liz 0.5% Triton X-100 / 0.5% dezoksikolat sodyòm/PBS ki gen fosfataz ak inibitè pwoteaz (Roche). Yo te fè kantifikasyon pwoteyin nan lè l sèvi avèk tès asid bicinchoninik (Thermo Fisher Scientific). Apre sa, yo te separe pwoteyin yo pa elektwoforèz jèl SDS-poliakrilamid, epi answit yo te transfere yo sou yon manbràn fliyò polivinilidèn (GE Healthcare). Bloke sit ki pa espesifik yo epi enkube yo ak antikò prensipal la (gade Tablo S1 pou plis detay) nan lèt 5% nan TBST (saline tamponne Tris ak Tween), etap lave yo ak antikò segondè a nan enkubasyon TBST. Enkube yo ak antikò prensipal la pandan tout lannwit lan a +4°C. Apre lave a, aplike antikò segondè a pandan 2 èdtan nan tanperati chanm. Apre sa, lè yo te enkube menm blot la ak yon antikò anti-β-aktin, yo te konfime menm chajman an. Deteksyon pa konvèti an chimiluminesans epi amelyore chimiluminesans (GE Healthcare).
Newòn yo te simen anvan sou lamèl an vè yo te fikse ak 4% paraformaldeyid (PFA)/PBS nan moman espesifye a nan tanperati chanm pandan 10 minit. Lamèl yo te premye penetre ak 0.1% Triton X-100/PBS pandan 5 minit nan tanperati chanm, epi answit nan tanpon blokaj [3% albumin serik bovin (BSA)/PBS]. Nan dezyèm jou a, lamèl yo te lave ak tanpon blokaj epi yo te enkube ak antikò segondè konjige ak fluorofò ki apwopriye a pandan 2 èdtan nan tanperati chanm; finalman, echantiyon yo te byen lave nan PBS ak 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ki te kont-kolore epi answit fikse sou lamèl mikwoskòp la ak Aqua-Poly/Mount.
Yo te anestezye sourit yo (mal ak femèl) avèk enjeksyon intraperitoneyal ketamin (130 mg/kg) ak ksilazin (10 mg/kg) epi yo te administre yo anba po ak analjezik karpwofèn (5 mg/kg). Yo te mete yo nan yon enstriman estereyotaksik (Kopf) ekipe ak yon kousen cho. Ekspoze zo bwa tèt la epi sèvi ak yon egzèsis dantè pou mens pati kòtèks serebeleuz ki koresponn ak zo mis la (soti nan lambda: ke 1.8, lateral 1, ki koresponn ak lobil IV ak V). Sèvi ak yon zegwi sereng koube pou kreye yon ti twou nan zo bwa tèt la avèk anpil atansyon pou evite deranje vaskilati ki anba a. Apre sa, yo mete kapilè an vè mens lan dousman nan mikwo-twou a (soti nan -1.3 rive nan -1 sou bò ventral dura mater la), epi yo enjekte 200 a 300 nl AAV nan mikwo-enjektè a (Narishige) avèk sereng manyèl (Narishige) plizyè fwa anba presyon ba pandan yon peryòd tan 10 a 20 minit. Apre perfusion an, mete kapilè a pou 10 minit anplis pou pèmèt viris la gaye nèt. Apre yo fin retire kapilè yo, yo suture po a ak anpil atansyon pou minimize enflamasyon blesi a epi pèmèt bèt la refè. Yo te trete bèt yo ak analjezik (caspofen) pandan plizyè jou apre operasyon an, pandan tan sa a yo te siveye kondisyon fizik yo ak anpil atansyon epi answit yo te fè eutanazi nan moman ki te endike a. Tout pwosedi yo te fèt an akò ak direktiv Ewopeyen yo, nasyonal yo ak enstitisyonèl yo epi LandesamtfürNatur nan Umwelt ak Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Almay te apwouve yo.
Yo te anestezye bèt yo ak ketamin (100 mg/kg) ak ksilazin (10 mg/kg), epi yo te fè pèfizyon kè a ak 0.1 M PBS an premye, epi answit ak 4% PFA nan PBS. Yo te disseke tisi a epi fikse li nan 4% PFA/PBS pandan tout lannwit lan a 4°C. Yo te itilize yon kouto ki vibre (Leica Microsystems GmbH, Vyèn, Otrich) pou prepare seksyon sajital (50 μm epesè) nan sèvo ki te fikse nan PBS. Sòf si yo presize otreman, yo te fè kolorasyon seksyon ki t ap flote lib yo jan sa dekri pi wo a (13) nan tanperati chanm epi yo t ap brase. An brèf, premyèman, yo te pèmeyabilize tranch yo jwenn yo ak 0.5% Triton X-100/PBS pandan 15 minit nan tanperati chanm; pou kèk epitòp (Pcx ak Shmt2), yo te chofe tranch yo pandan 25 minit olye de etap sa a nan yon tanpon tris-EDTA a 80°C (PH 9). Apre sa, seksyon yo te enkube ak antikò prensipal la (gade Tablo S1) nan yon tanpon blokaj (3% BSA/PBS) a 4°C pandan tout lannwit lan avèk ajitasyon. Nan jou ki te vin apre a, seksyon yo te lave ak tanpon blokaj epi yo te enkube ak antikò segondè konjige ak fluorofò ki apwopriye a pandan 2 èdtan nan tanperati chanm; finalman, seksyon yo te lave byen nan PBS, yo te fè yon kont-kolore ak DAPI, epi answit yo te fikse ak AquaPolymount sou yon lam mikwoskòp.
Yo te itilize yon mikwoskòp konfokal lazè (TCS SP8-X oubyen TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ekipe ak yon lazè limyè blan ak yon lazè iltravyolèt 405 dyòd pou pran imaj echantiyon an. Lè yo te eksite fluorofò a epi kolekte siyal la ak Detektè Ibrid (HyDs), yo te itilize lojisyèl LAS-X la pou kolekte imaj anpile ki konfòm ak echantiyonaj Nyquist nan mòd sekansyèl: pou panèl ki pa kantitatif, li se siyal trè dinamik (pa egzanp, nan selil somatik ak dendrit) mtYFP) Sèvi ak HyD pou detekte kantite PN nan mòd BrightR). Yo aplike yon pòtay soti nan 0.3 a 6 ns pou diminye background nan.
Imajri an tan reyèl selil klase yo. Apre klasman nan medyòm Neurobasal-A ki gen 1% sipleman B27 ak 0.5 mM GlutaMax, selil yo te simen imedyatman sou lam vè kouvri ak poli-l-lizin (μ-Slide8 Well, Ibidi, nimewo katalòg 80826), epi kenbe l nan 37°C ak 5% CO2 pandan 1 èdtan pou pèmèt selil yo etabli. Imajri an tan reyèl te fèt sou yon mikwoskòp konfokal lazè eskanè Leica SP8 ekipe ak yon lazè blan, HyD, yon lantiy objektif lwil 63×[1.4 ouvèti nimerik (NA)] ak yon etap chofaj.
Yo te anestezye sourit la byen vit ak diyoksid kabòn epi yo te dekapite l, yo te retire sèvo a byen vit nan zo bwa tèt la, epi yo te koupe l an seksyon sajital 200μm epesè (pou eksperyans maketaj 13C) oswa 275μm epesè (pou eksperyans de foton) ki te ranpli ak materyèl sa yo. Krèm glase a (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Almay) te ranpli ak sibstans sa yo: 125 mM likid sefaloraken atifisyèl (ACSF) ki frèt tankou glas, satire ak kabòn (95% O2 ak 5% CO2) ki ba an Ca2 + NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tanpon fosfat sodyòm, 25 mM NaHCO3, 25 mM glikoz, 0.5 mM CaCl2 ak 3.5 mM MgCl2 (presyon osmotik 310 a 330 mmol). Transfere tranch sèvo yo jwenn nan yon chanm pre-enkibasyon ki gen yon pi gwo Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tanpon fosfat sodyòm, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glikoz, 1.0 mM CaCl2 ak 2.0 mM MgCl2) mwayen) pH 7.4 ak 310 a 320 mmol).
Pandan pwosesis imajri a, yo te deplase tranch yo nan yon chanm imajri espesyal, epi yo te fè eksperyans lan anba pèfizyon ACSF kontinyèl nan yon tanperati konstan ant 32° ak 33°C. Yo te itilize yon mikwoskòp lazè miltifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ekipe ak yon lantiy objektif Leica 25x (NA 0.95, dlo), yon lazè Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) pou imajri tranch yo. Modil FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Chanjman nan eta redoks sitoplasmik PN yo te mezire pa FLIM de foton nan tranch sagital nan sèvo, kote byosansè Grx1-roGFP2 la te vize PN yo. Nan kouch PN a, chan akizisyon an chwazi apeprè 50 a 80 μm anba sifas tranch la pou asire ke gen yon PN ki solid (sa vle di, absans estrikti pèl oswa chanjman mòfolojik newòn sou dendrit yo) ak doub detèktè roGFP2 pozitif la ak AAV ki kode shRNA PCx oswa sekans kontwòl li (chak ko-eksprime mCherry). Kolekte imaj yon sèl pil ak zoom dijital 2x [longèdonn eksitasyon: 890 nm; 512 nm 512 piksèl]. Deteksyon: HyD entèn, gwoup filtè izotiyosyanat fliyoresein (FITC)] ak mwayèn imaj nan 2 a 3 minit yo itilize pou asire ke ase foton yo kolekte (1000 foton an total) pou ajisteman koub. Yo te fè sansiblite sond Grx1-roGFP2 la ak verifikasyon kondisyon FLIM yo lè yo te siveye valè dire lavi roGFP2 a lè yo te ajoute 10 mM H2O2 ekzojèn nan ACSF pèfizyon an (pou maksimize oksidasyon, sa ki lakòz yon ogmantasyon nan dire lavi a), epi answit ajoute 2 mM ditiyotritol (minimize degre rediksyon an, sa ki lakòz yon diminisyon nan dire lavi a) (Figi S8, D rive G). Sèvi ak lojisyèl FLIMfit 5.1.1 pou analize rezilta yo te jwenn yo, adapte koub dekwasans eksponansyèl imaj la nèt ak IRF (fonksyon repons enstriman an) ki te mezire a, epi χ2 se apeprè 1. Pou kalkile dire lavi yon sèl PN, yo te trase mask ki ozalantou kò nè a manyèlman, epi yo te itilize dire lavi mwayèn nan chak mask pou kantifikasyon.
Analiz potansyèl mitokondriyal. Apre yo te fin enkube seksyon egi a avèk 100 nM TMRM ajoute dirèkteman nan ACSF ki te pèfize a pandan 30 minit, yo te mezire chanjman potansyèl mitokondriyal PN yo avèk yon mikwoskòp de foton. Yo te fè imaj TMRM la lè yo te eksite sond lan a 920 nm epi yo te itilize HyD entèn (tetrametilrodamin izotiyosyanat: 585/40 nm) pou kolekte siyal yo; lè yo te itilize menm longèdonn eksitasyon an men lè yo te itilize yon HyD entèn diferan (FITC :525/50) pou pran imaj mtYFP. Sèvi ak plugin Image Calculator ImageJ a pou evalye potansyèl mitokondriyal la nan nivo yon sèl selil. An brèf, yo itilize ekwasyon plugin nan: siyal = min (mtYFP, TMRM) pou idantifye rejyon mitokondriyal ki montre siyal TMRM nan Purkinje Somali nan imaj konfokal yon sèl pil kanal korespondan an. Apre sa, yo kantifye zòn pixel ki nan mask ki rezilta a, epi yo normalize li sou imaj single-stack papòt ki koresponn lan nan kanal mtYFP la pou jwenn fraksyon mitokondriyal ki montre potansyèl mitokondriyal la.
Yo te dekonvoluye imaj la avèk lojisyèl Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pou imaj eskane mozayik yo, yo te fè montaj yon sèl mozayik avèk algoritm asanblaj otomatik lojisyèl LAS-X la bay la. Apre kalibrasyon imaj la, sèvi ak ImageJ ak Adobe Photoshop pou kontinye pwosesis imaj la epi ajiste klète ak kontras la inifòmman. Sèvi ak Adobe Illustrator pou preparasyon grafik la.
Analiz konsantrasyon ADNmt. Yo te mezire kantite lezyon ADNmt sou seksyon serebele ki make ak antikò kont ADN pa mikwoskòp konfokal. Yo te kreye chak zòn sib pou kò selilè a ak nwayo chak selil, epi yo te kalkile zòn respektif la lè l sèvi avèk Plugin Multi Measure (lojisyèl ImageJ). Soustrè zòn nikleyè a nan zòn kò selilè a pou jwenn zòn sitoplasmik la. Finalman, yo te itilize Plugin Analyze Particles (lojisyèl ImageJ) pou otomatikman mezire pwen ADN sitoplasmik ki endike ADNmt sou imaj papòt la, epi yo te nòmalize rezilta yo jwenn yo ak mwayèn PN sourit CTRL yo. Rezilta yo eksprime kòm kantite mwayèn nikleyozid pa selil.
Analiz ekspresyon pwoteyin. Sèvi ak plugin Image Calculator ImageJ a pou evalye ekspresyon pwoteyin nan PN nan nivo yon sèl selil. An brèf, nan imaj konfokal yon sèl kouch kanal korespondan an, atravè ekwasyon an: siyal = min (mtYFP, antikò), yo idantifye rejyon mitokondriyal ki montre imunoreyaktivite a yon sèten antikò nan Purkina. Apre sa, yo kantifye zòn pixel nan mask ki kapab lakòz la, epi answit yo normalize li sou imaj yon sèl pil papòt korespondan nan kanal mtYFP a pou jwenn fraksyon mitokondriyal pwoteyin ki parèt la.
Analiz dansite selil Purkinje. Plugin Cell Counter nan ImageJ te itilize pou evalye dansite Purkinje a lè yo te divize kantite selil Purkinje yo te konte pa longè bag serebeleuz ki okipe pa selil yo te konte yo.
Preparasyon ak koleksyon echantiyon. Yo te fikse sèvo gwoup kontwòl la ak sourit Mfn2cKO yo nan 2% PFA/2.5% glutaraldeyid nan 0.1 M tanpon fosfat (PB), epi answit yo te prepare seksyon koronal yo lè l sèvi avèk silyat (Leica Mikrosysteme GmbH, Vyèn, Otrich) (Epesè 50 a 60 μm). Apre sa, yo te fikse yo nan tanpon PB nan 1% tetraoksid ak 1.5% ferosyanid potasyòm nan tanperati chanm pandan 1 èdtan. Yo te lave seksyon yo twa fwa ak dlo distile, epi answit yo te kolore yo ak 70% etanòl ki gen 1% asetat uranil pandan 20 minit. Apre sa, yo te dezidrate seksyon yo nan alkòl gradye epi yo te entegre yo nan résine epoksi Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, nimewo katalòg 14040) ant lam vè kouvri ak silikon, epi finalman yo te polimerize yo nan fou a pandan 48 èdtan a 60°C. Yo te chwazi zòn korteks serebele a epi yo te koupe seksyon ultramens 50 nm sou Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vyèn, Otrich) epi yo te pran yo sou yon griy fant kwiv 2×1 mm kouvri ak fim polystyrène. Yo te kolore seksyon yo ak yon solisyon 4% asetat uranil nan H2O pandan 10 minit, yo te lave yo ak H2O plizyè fwa, answit ak sitrat plon Reynolds nan H2O pandan 10 minit, epi answit yo te lave yo ak H2O plizyè fwa. Yo te pran mikwo-graf yo ak yon mikwoskòp elektwonik transmisyon Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) lè l sèvi avèk yon kamera dijital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Almay).
Pou sourit ki enfekte ak AAV, yo te separe sèvo a epi koupe l an tranch sajital 1 mm epesè, epi yo te egzamine serebelo a lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fluoresans pou idantifye bag ki enfekte ak AAV la (sa vle di, ki eksprime mCherry). Se sèlman eksperyans kote enjeksyon AAV la bay yon efikasite transdiksyon ki wo anpil nan kouch selil Purkinje a (sa vle di prèske tout kouch la) nan omwen de bag serebeleuz youn apre lòt yo te itilize. Bouk transdisyone ak AAV la te mikwodiseke pou yon apre fiksasyon lannwit lan (4% PFA ak 2.5% glutaraldeyid nan 0.1 M tampon kokoat) epi yo te trete l pi lwen. Pou enklizyon EPON, yo te lave tisi fiks la ak 0.1 M tampon kokoat sodyòm (Applicihem), epi yo te enkube l ak 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) nan 0.1 M tampon kokoat sodyòm (Applicihem) pandan 4 èdtan, answit lave l pandan 2 èdtan. Repete 3 fwa ak 0.1 M tampon kokamid. Apre sa, yo te itilize seri etanòl asandan an pou enkube chak solisyon etanòl a 4°C pandan 15 minit pou dezidrate tisi a. Yo te transfere tisi a nan oksid propilèn epi yo te enkube l pandan tout lannwit nan EPON (Sigma-Aldrich) a 4°C. Mete tisi a nan EPON fre a tanperati chanm pandan 2 èdtan, epi answit mete l nan 62°C pandan 72 èdtan. Sèvi ak yon ultramikrotòm ​​(Leica Microsystems, UC6) ak yon kouto dyaman (Diatome, Biel, Swis) pou koupe seksyon ultramens 70 nm, epi kolore yo ak 1.5% asetat uranil pandan 15 minit a 37°C, epi kolore yo ak solisyon sitrat plon pandan 4 minit. Yo te pran mikwograf elektwonik yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elektwonik transmisyon JEM-2100 Plus (JEOL) ekipe ak Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ak lojisyèl DigitalMicrograph (Gatan). Pou analiz la, yo te pran mikwo-grafi elektwonik ak yon zoom dijital 5000× oswa 10,000×.
Analiz mòfolojik mitokondri yo. Pou tout analiz yo, kontou chak mitokondri te trase manyèlman nan imaj dijital lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ. Diferan paramèt mòfolojik yo te analize. Dansite mitokondri a eksprime kòm yon pousantaj ki jwenn lè yo divize sifas mitokondri total chak selil pa sifas sitoplasm lan (sifas sitoplasm = sifas selil - sifas nwayo selil) × 100. Awondi mitokondri yo kalkile avèk fòmil [4π∙(sifas/perimèt 2)]. Yo te analize mòfoloji mitokondri yo epi divize yo an de kategori ("tibilè" ak "anpoul") selon fòm prensipal yo.
Analiz kantite ak dansite otofagozòm/lizozòm. Sèvi ak lojisyèl ImageJ pou trase kontou chak otofagozòm/lizozòm manyèlman nan imaj dijital la. Zòn otofagozòm/lizozòm nan eksprime kòm yon pousantaj ki kalkile lè yo divize zòn total estrikti otofagozòm/lizozòm chak selil pa zòn sitoplasm lan (zòn sitoplasm = zòn selil - zòn nwayo) × 100. Dansite otofagozòm/lizozòm yo kalkile lè yo divize kantite total la pa kantite estrikti otofagozòm/lizozòm pa selil (an tèm de zòn sitoplasmik) (zòn sitoplasmik = zòn selil - zòn nikleyè).
Etikèt pou seksyonaj egi ak preparasyon echantiyon. Pou eksperyans ki mande etikèt glikoz, transfere tranch sèvo egi yo nan yon chanm pre-enkibasyon, ki gen kabòn satire (95% O2 ak 5% CO2), gwo Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tanpon fosfat sodyòm, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glikoz, 1.0 mM CaCl2 ak 2.0 mM MgCl2, ajiste a pH 7.4 ak 310 a 320 mOsm), kote glikoz se sibstitisyon 13C6-glikoz (Eurisotop, nimewo katalòg CLM-1396). Pou eksperyans ki mande pou make ak piruvat, transfere tranch sèvo egi yo nan yon pi gwo Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfat sodyòm, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glikoz, 1.0 mM CaCl2 epi ajoute 2.0mM MgCl2, ajiste a pH 7.4 ak 310 a 320mOsm), epi ajoute 1mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nimewo katalòg CLM-1082). Enkube seksyon yo pandan 90 minit a 37°C. Nan fen eksperyans lan, seksyon yo te lave byen vit ak yon solisyon akeuz (pH 7.4) ki gen 75 mM kabonat amonyòm, epi answit omojeneize nan 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanòl: dlo. Apre yo te fin enkube seksyon yo sou glas pandan 30 minit, echantiyon yo te santrifije a 21,000 g pandan 10 minit a 4°C, epi yo te seche sipènatant klè a nan yon konsantratè SpeedVac. Yo te konsève grenn metabolit seche ki te sòti a a -80°C jiskaske yo te fè analiz la.
Analiz kromatografi likid-espektrometri mas sou asid amine ki make ak 13C. Pou analiz kromatografi likid-espektrometri mas (LC-MS), yo te resispann grenn metabolit la nan 75μl dlo klas LC-MS (Honeywell). Apre santrifijasyon a 21,000 g pandan 5 minit a 4°C, yo te itilize 20 μl nan sipènatant klarifye a pou analiz flux asid amine, pandan ke yo te itilize rès ekstrè a imedyatman pou analiz anyon (gade anba a). Yo te fè analiz asid amine a lè l sèvi avèk pwotokòl derivatizasyon klori benzoil ki te dekri deja a (55, 56). Nan premye etap la, yo te ajoute 10μl kabonat sodyòm 100 mM (Sigma-Aldrich) nan 20μl ekstrè metabolit la, epi answit yo te ajoute 10μl klori benzoil 2% (Sigma-Aldrich) nan ACN klas LC a. Yo te brase echantiyon an yon ti tan nan yon vortex epi answit yo te santrifije l a 21,000 g pandan 5 minit a 20°C. Transfere sipènatant ki te netwaye a nan yon ti boutèy oto-echantiyonè 2 ml ak yon insert an vè konik (volim 200 μl). Yo te analize echantiyon yo lè l sèvi avèk sistèm LC pèfòmans ultra-wo Acquity iClass (Waters) ki konekte ak espektwomèt mas presizyon wo rezolisyon Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Pou analiz la, yo te enjekte 2 μl nan echantiyon derive a nan yon kolòn silica T3 wo rezistans 100 × 1.0 mm (Waters) ki gen patikil 1.8 μm. Debi a se 100 μl/min, epi sistèm tanpon an konsiste de tanpon A (10 mM fòmat amonyòm ak 0.15% asid formik nan dlo) ak tanpon B (ACN). Gradyan an se jan sa a: 0%B a 0 minit; 0%B. 0 a 15% B nan 0 a 0.1 minit; 15 a 17% B nan 0.1 a 0.5 minit; B nan 17 a 55% nan 0.5 a 14 minit; B nan 55 a 70% nan 14 a 14.5 minit; nan 14.5 a 70 a 100% B nan 18 minit; 100% B nan 18 a 19 minit; 100 a 0% B nan 19 a 19.1 minit; 0% B nan 19.1 a 28 minit (55, 56). Espektwomèt mas QE-HF la fonksyone nan mòd iyonizasyon pozitif ak yon seri mas m/z (rapò mas/chaj) soti nan 50 a 750. Rezolisyon ki aplike a se 60,000, epi sib iyon kontwòl gen (AGC) ki jwenn nan se 3 × 106, epi tan maksimòm iyon an se 100 milisgond. Sous iyonizasyon elektwoespre chofe a (ESI) fonksyone nan yon vòltaj espre 3.5 kV, yon tanperati kapilè 250 °C, yon koule lè nan kouch 60 AU (inite abitrè), ak yon koule lè oksilyè 20 AU. 250 °C. Lantiy S la fikse sou 60 AU.
Analiz kromatografi anyon-MS asid òganik ki make ak 13C. Yo te analize presipite metabolit ki rete a (55μl) lè l sèvi avèk yon sistèm kromatografi iyon Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) konekte ak yon espektwomèt mas QE-HF (Thermo Fisher Scientific). An brèf, yo te enjekte 5μl ekstrè metabolit nan yon kolòn Dionex IonPac AS11-HC ekipe ak HPLC (2 mm × 250 mm, gwosè patikil 4μm, Thermo Fisher Scientific) nan mòd bouk pasyèl push-in ak yon rapò ranpli 1.) Kolòn gad Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Yo kenbe tanperati kolòn nan a 30°C, epi yo mete oto-echantiyonè a sou 6°C. Sèvi ak yon katouch idroksid potasyòm ki gen dlo deyonize pou jenere yon gradyan idroksid potasyòm atravè dèlko elyan an. Separasyon metabolit yo nan yon vitès koule 380μl/min, aplike gradyan sa a: 0 a 3 minit, 10 mM KOH; 3 a 12 minit, 10 a 50 mM KOH; 12 a 19 minit, 50 a 100 mM KOH; 19 a 21 minit, 100 mM KOH; 21 a 21.5 minit, 100 a 10 mM KOH. Kolòn nan te re-ekilibre anba 10 mM KOH pandan 8.5 minit.
Metabolit ki elimine yo konbine avèk yon kouran sipleman izopropanol 150μl/min apre kolòn nan epi answit dirije yo nan yon espektwomèt mas wo rezolisyon k ap opere nan mòd iyonizasyon negatif. MS ap siveye seri mas la soti nan m/z 50 a 750 ak yon rezolisyon 60,000. AGC a fikse sou 1×106, epi tan maksimòm iyon an kenbe nan 100 ms. Sous ESI chofe a te opere nan yon vòltaj espre 3.5 kV. Lòt paramèt sous iyon an yo se jan sa a: tanperati kapilè 275°C; koule gaz anvlòp, 60 AU; koule gaz oksilyè, 20 AU a 300°C, ak paramèt lantiy S a 60 AU.
Analiz done metabolit ki make ak 13C. Sèvi ak lojisyèl TraceFinder (vèsyon 4.2, Thermo Fisher Scientific) pou analiz done rapò izotop yo. Idantite chak konpoze te verifye pa yon konpoze referans serye epi analize endepandamman. Pou fè analiz anrichisman izotop, zòn kromatogram iyon ki te ekstrè a (XIC) nan chak izotop 13C (Mn) te ekstrè nan [M + H] +, kote n se nimewo kabòn konpoze sib la, yo itilize pou analize asid amine oubyen [MH] + yo itilize pou analize anyon yo. Presizyon mas XIC a mwens pase senk pati pa milyon, epi presizyon RT a se 0.05 minit. Analiz anrichisman an fèt lè yo kalkile rapò chak izotop detekte ak sòm tout izotop konpoze korespondan an. Rapò sa yo bay kòm valè pousantaj pou chak izotop, epi rezilta yo eksprime kòm pousantaj anrichisman molè (MPE), jan sa dekri deja (42).
Yo te omojene grenn newòn ki te konjele a nan metanol 80% (v/v) ki te frèt tankou glas, yo te brase l nan vortex, epi yo te enkube l nan -20°C pandan 30 minit. Brase echantiyon an ankò nan vortex epi brase l nan +4°C pandan 30 minit. Yo te santrifije echantiyon an nan 21,000 g pandan 5 minit nan 4°C, epi answit yo te kolekte sipènatant ki te sòti a epi yo te seche l lè l sèvi avèk yon konsantratè SpeedVac nan 25°C pou analiz ki vin apre. Jan sa dekri pi wo a, yo te fè analiz LC-MS sou asid amine selil yo te klase yo. Yo te itilize TraceFinder (vèsyon 4.2, Thermo Fisher Scientific), pou fè analiz done yo lè l sèvi avèk mas monoizotopik chak konpoze. Yo te fè nòmalizasyon kantil done metabolit yo lè l sèvi avèk pake lojisyèl preprocessCore (57).
Preparasyon tranch. Yo te anestezye sourit la byen vit ak diyoksid kabòn epi yo te dekapite l, yo te retire sèvo a byen vit nan zo bwa tèt la, epi yo te itilize kouto vibran plen glas la (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Almay) pou koupe l an seksyon sajital 300 a 375 μm. Gazifikasyon kabòn frèt (95% O2 ak 5% CO2). Ba Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfat sodyòm, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glikoz, 1.0 mM CaCl2 ak 6.0 mM MgCl2. Ajiste a pH 7.4 ak 310 a 330 mOsm). Transfere tranch sèvo yo jwenn nan yon chanm ki gen plis Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tanpon fosfat sodyòm, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glikoz, 4.0 mM CaCl2 ak mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ak 310 a 320 mOsm). Sere tranch yo pandan 20 a 30 minit pou yo ka retabli yo anvan anrejistreman.
anrejistreman. Yo te itilize yon plat mikwoskòp ekipe ak yon chanm anrejistreman fiks ak yon lantiy objektif imèsyon dlo 20x (Scientifica) pou tout anrejistreman yo. Yo te idantifye selil Purkinje swadizan yo pa (i) gwosè kò a, (ii) kote anatomik serebelo a, ak (iii) ekspresyon jèn rapòtè fliyoresan mtYFP la. Yo rale pipèt patch la ak yon rezistans pwent 5 a 11 megohm pa yon kapilè an vè borosilikat (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Almay) ak yon pipèt orizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Tout anrejistreman yo te fèt pa anplifikatè patch clamp ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Almay), ki te kontwole pa lojisyèl Signal la (vèsyon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Yo te anrejistre eksperyans lan nan yon vitès echantiyonaj 12.5 kHz. Siyal la filtre ak de filtè Bessel pas kout ak frekans koupe 1.3 ak 10 kHz respektivman. Kapasitans manbràn lan ak pipèt la konpanse pa sikwi konpansasyon an lè l sèvi avèk anplifikatè a. Tout eksperyans yo te fèt anba kontwòl yon kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Almay), ki te kontwole pa lojisyèl Hokawo a (vèsyon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Almay).
Konfigirasyon ak analiz woutin selil antye. Touswit anvan anrejistreman an, ranpli pipèt la ak solisyon entèn ki gen sibstans sa yo: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM glukonat potasyòm, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine trifosfat (GTP) (Na) ak 10.0 mM kreyatinin fosfat te ajiste a pH 7.25, epi presyon osmotik la te 290 mOsm (sikwoz). Touswit apre yo fin aplike yon fòs 0 pA pou kraze manbràn nan, yo mezire potansyèl manbràn repo a. Rezistans antre a mezire lè yo aplike kouran ipèpolarize -40, -30, -20, ak -10 pA. Mezire mayitid repons vòltaj la epi sèvi ak lwa Ohm pou kalkile rezistans antre a. Yo te anrejistre aktivite espontane a nan yon kranpon vòltaj pandan 5 minit, epi yo te idantifye epi mezire sPSC a nan Igor Pro (vèsyon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) lè l sèvi avèk yon script rekonesans semi-otomatik. Yo mezire koub IV a ak kouran eta estab la lè yo bloke batri a nan diferan potansyèl (kòmanse soti nan -110 mV) epi ogmante vòltaj la nan etap 5 mV. Yo te teste pwodiksyon AP a lè yo te aplike yon kouran depolarizan. Kranpon selil la nan -70 mV pandan w ap aplike yon pulsasyon kouran depolarizan. Ajiste gwosè etap chak inite anrejistreman separeman (10 a 60 pA). Kalkile frekans maksimòm AP a lè w konte manyèlman pik pulsasyon yo ki lakòz pi gwo frekans AP a. Yo analize papòt AP a lè l sèvi avèk dezyèm derivatif pulsasyon depolarizasyon an ki deklanche youn oubyen plizyè AP an premye.
Konfigirasyon ak analiz patch pèfore a. Fè anrejistreman patch pèfore a lè l sèvi avèk pwotokòl estanda yo. Sèvi ak yon pipèt san ATP ak GTP ki pa gen engredyan sa yo: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ak 2 mM MgCl2, epi ajiste a pH 7.2 (lè l sèvi avèk KOH). ATP ak GTP yo retire nan solisyon entraselulè a ​​pou anpeche pèmeyabilite san kontwòl nan manbràn selilè a. Pipèt patch la ranpli ak yon solisyon entèn ki gen anfotèrisin (apeprè 200 a 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) pou jwenn yon anrejistreman patch pèfore. Anfotèrisin te fonn nan dimetil silfoksid (konsantrasyon final: 0.1 a 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsantrasyon DMSO ki te itilize a pa t gen okenn efè siyifikatif sou newòn yo te etidye yo. Pandan pwosesis pwensonaj la, rezistans kanal la (Ra) te kontwole kontinyèlman, epi eksperyans lan te kòmanse apre anplitid Ra ak AP te estabilize (20-40 minit). Aktivite espontane a te mezire nan yon kranpon vòltaj ak/oswa kouran pandan 2 a 5 minit. Analiz done yo te fèt lè l sèvi avèk Igor Pro (vèsyon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (vèsyon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) ak GraphPad Prism (vèsyon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA (Etazini). Pou idantifye AP espontane yo, yo te itilize plugin NeuroMatic v3.0c IgorPro a. Idantifye AP yo otomatikman lè l sèvi avèk yon papòt bay, ki ajiste endividyèlman pou chak anrejistreman. Lè l sèvi avèk entèval pik la, detèmine frekans pik la ak frekans pik maksimòm enstantane a ak frekans pik mwayèn nan.
Izolasyon PN. Lè yo te adapte ak pwotokòl ki te pibliye deja a, yo te pirifye PN yo nan serebelo sourit la nan yon etap espesifik (58). An brèf, yo te disseke serebelo a epi yo te rache l nan yon mwayen disosyasyon frèt tankou glas [san HBSS Ca2+ ak Mg2+, complété ak 20 mM glikoz, penisilin (50 U/ml) ak streptomisin (0.05 mg/ml)], epi answit yo te dijere mwayen an nan papain [HBSS, complété ak 1-sisteyin·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) ak dezoksiribonikleaz I (DNaz I; 0.1 mg/ml)]. Trete pandan 30 minit a 30°C. Premyèman, lave tisi yo nan yon mwayen HBSS ki gen ladan l larim ze (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ak DNaz (0.1 mg/ml) nan tanperati chanm pou anpeche dijesyon anzimatik, epi answit nan mwayen HBSS ki gen 20 mM glikoz. Brase dousman nan HBSS, penisilin (50 U/ml), streptomisin (0.05 mg/ml) ak DNaz (0.1 mg/ml) pou libere selil endividyèl yo. Sispansyon selil ki te sòti a te filtre atravè yon paswa selilè 70μm, answit selil yo te rasanble pa santrifijasyon (1110 rpm, 5 minit, 4°C) epi yo te resispann yo nan mwayen klasman [HBSS, complété ak 20 mM glikoz, 20% seròm fetal bovin, penisilin (50 U/ml) ak streptomisin (0.05 mg/ml)]; evalye viabilité selilè a ak yodid propidyòm epi ajiste dansite selilè a a 1×10⁶ a 2×10⁶ selil/ml. Anvan sitometri koule a, sispansyon an te filtre atravè yon paswa selilè 50 μm.
Sitomèt koule. Yo te fè klasman selilè a 4°C lè l sèvi avèk machin FACSAria III (BD Biosciences) ak lojisyèl FACSDiva (BD Biosciences, vèsyon 8.0.1). Yo te klase sispansyon selilè a lè l sèvi avèk yon bouch 100 μm anba yon presyon 20 psi nan yon vitès ~2800 evènman/segonn. Piske kritè tradisyonèl pou fèmen pòt yo (gwosè selil, diskriminasyon bimodal, ak karakteristik dispèsyon) pa ka asire bon izolasyon PN nan lòt kalite selil, yo etabli estrateji fèmen pòt yo baze sou konparezon dirèk entansite YFP ak otofluoresans nan sourit mitoYFP+ ​​ak sourit kontwòl mitoYFP − yo. Yo eksite YFP lè yo iradyasyon echantiyon an avèk yon liy lazè 488 nm, epi yo detekte siyal la lè l sèvi avèk yon filtè pasaj bann 530/30 nm. Nan sourit mitoYFP+, yo itilize fòs relatif jèn rapòtè Rosa26-mitoYFP la tou pou distenge kò newòn ak fragman akson yo. Yo eksite 7-AAD ak yon lazè jòn 561 nm epi yo detekte l ak yon filtè bandpass 675/20 nm pou elimine selil mouri yo. Pou separe astrosit yo an menm tan, yo te kolore sispansyon selilè a ak ACSA-2-APC, answit yo te iradyasyon echantiyon an ak yon liy lazè 640 nm, epi yo te itilize yon filtè bandpass 660/20 nm pou detekte siyal la.
Selil yo te kolekte yo te santrifije (1110 rpm, 5 minit, 4°C) epi yo te estoke yo nan -80°C jiskaske yo itilize yo. Sourit Mfn2cKO yo ak ti pitit yo klase nan menm jou a pou minimize varyabilite pwosedi yo. Prezantasyon ak analiz done FACS yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Jan nou mansyone pi wo a (59), yo itilize PCR an tan reyèl pou izole ADN nan newòn yo klase pou kantifikasyon mtDNA ki vin apre a. Yo te teste lineyarite ak sansiblite papòt la okòmansman lè yo te fè qPCR sou diferan kantite selil. An brèf, kolekte 300 PN nan yon tanpon liz ki gen ladan 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ak pwoteyinaz K (200 ng/ml) epi enkube nan 55°C pandan 120 minit. Yo te plis enkube selil yo nan 95°C pandan 10 minit pou asire inaktivasyon konplè pwoteyinaz K la. Lè yo te itilize yon sond TaqMan (Thermo Fisher) espesifik pou mt-Nd1, yo te mezire mtDNA pa PCR semi-kantitatif nan sistèm PCR an tan reyèl 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Syans, nimewo katalòg Mm04225274_s1), jèn mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nimewo katalòg AIVI3E8) ak jèn 18S (Thermo Fisher Scientific, nimewo katalòg Hs99999901_s1).
Preparasyon echantiyon pwoteyòm. Lè yo chofe solisyon an a 95°C pandan 10 minit epi yo sonike li, nan tanpon liz la [6 M klori guanidin, 10 mM tris(2-karboksetikil) fosfin kloridrat, 10 mM kloroasetamid ak 100 mM tris-Lize grenn newòn konjele nan HCl]. Sou Bioruptor (Diagenode) pandan 10 minit (30 segonn pulsasyon / 30 segonn peryòd poz). Echantiyon an te delye 1:10 nan 20 mM tris-HCl (pH 8.0), melanje ak 300 ng lò tripsin (Promega), epi enkube pandan tout lannwit lan a 37°C pou reyalize yon dijesyon konplè. Nan dezyèm jou a, echantiyon an te santrifije a 20,000 g pandan 20 minit. Sipènatant la te delye ak 0.1% asid formik, epi solisyon an te desalye ak StageTips fèt lakay. Yo te seche echantiyon an nan yon enstriman SpeedVac (konsantratè Eppendorf plis 5305) a 45°C, epi answit yo te sispann peptid la nan 0.1% asid formik. Menm moun nan te prepare tout echantiyon yo an menm tan. Pou analize echantiyon astrosit yo, yo te make 4 μg peptid desaled ak yon etikèt mas tandem (TMT10plex, nimewo katalòg 90110, Thermo Fisher Scientific) ak yon rapò peptid ak reyaktif TMT 1:20. Pou make TMT, yo te resispann 0.8 mg reyaktif TMT nan 70 μl ACN anid, epi yo te rekonstitye peptid seche a nan 9 μl 0.1 M TEAB (bikabonat triyetilamonyòm), epi yo te ajoute 7 μl reyaktif TMT nan ACN. Konsantrasyon an te 43.75%. Apre 60 minit enkubasyon, yo te etenn reyaksyon an ak 2 μl idroksilamin 5%. Peptid ki make yo te kolekte, seche, resispann nan 200μl asid formik (FA) 0.1%, divize an de, epi answit desalye yo lè l sèvi avèk StageTips yo te fè tèt yo. Lè l sèvi avèk kwomatograf likid pèfòmans ultra wo UltiMate 3000 (kwomatograf likid pèfòmans ultra wo UltiMate 3000), youn nan de mwatye yo te fraksyone sou yon kolòn kwomatograf Acquity 1mm x 150mm ki te ranpli ak patikil C18 130Å1.7μm (Waters, nimewo katalòg SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separe peptid yo nan yon vitès koule 30μl/min, separe de 1% a 50% tanpon B pandan 85 minit ak yon gradyan etap pa etap pandan 96 minit, de 50% a 95% tanpon B pandan 3 minit, answit 8 minit pou 95% Tanpon B; Tanpon A a se 5% ACN ak 10 mM bikabonat amonyòm (ABC), epi tanpon B a se 80% ACN ak 10 mM ABC. Kolekte fraksyon yo chak 3 minit epi konbine yo an de gwoup (1 + 17, 2 + 18, elatriye) epi seche yo nan yon santrifij vid.
Analiz LC-MS/MS. Pou espektwometri mas, peptid yo (nimewo r119.aq) te separe sou yon kolòn analiz PicoFrit 25 cm, 75 μm dyamèt enteryè (nouvo lantiy objektif, nimewo pyès PF7508250) ekipe ak 1.9 μm medyòm ReproSil-Pur 120 C18-AQ (Dr. Maisch, mat), Sèvi ak EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Almay). Kolòn nan te kenbe a 50°C. Tanpon A ak B yo se 0.1% asid formik nan dlo ak 0.1% asid formik nan 80% ACN, respektivman. Peptid yo te separe soti nan 6% a 31% tanpon B pandan 65 minit ak soti nan 31% a 50% tanpon B pandan 5 minit ak yon gradyan 200 nl/min. Peptid yo te elimine yo te analize sou yon espektwometri mas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Mezi m/z prekisè peptid la fèt ak yon rezolisyon 120,000 nan yon seri 350 a 1500 m/z. Lè l sèvi avèk 27% enèji kolizyon nòmalize, yo chwazi prekisè ki pi fò a ak yon eta chaj 2 a 6 pou klivaj disosyasyon pyèj C (HCD) ki gen gwo enèji. Tan sik la fikse a 1 s. Yo mezire valè m/z fragman peptid la nan pyèj iyon an lè l sèvi avèk pi piti sib AGC 5×104 ak tan enjeksyon maksimòm 86 ms. Apre fragmentasyon an, yo mete prekisè a sou lis esklizyon dinamik la pandan 45 s. Peptid ki make ak TMT yo te separe sou yon kolòn Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nimewo katalòg 164942), epi spectre migrasyon yo te analize sou yon espektwomèt mas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ekipe ak ekipman iyon fòm ond asimetrik gwo chan (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ki fonksyone nan de vòltaj konpansasyon -50 ak -70 V. MS3 ki chwazi dapre prekisè senkronizasyon an itilize pou mezi siyal iyon rapò TMT. Separasyon peptid la te fèt sou EASY-nLC 1200, lè l sèvi avèk yon elisyon gradyan lineyè 90%, ak yon konsantrasyon tanpon 6% a 31%; tanpon A te 0.1% FA, epi tanpon B te 0.1% FA ak 80% ACN. Kolòn analiz la fonksyone a 50°C. Sèvi ak FreeStyle (vèsyon 1.6, Thermo Fisher Scientific) pou divize fichye orijinal la dapre vòltaj konpansasyon FAIMS la.
Idantifikasyon ak kantifikasyon pwoteyin. Lè l sèvi avèk motè rechèch entegre Andromeda a, done orijinal yo te analize avèk MaxQuant vèsyon 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Anplis sekans rekombinaz Cre ak YFP yo te jwenn nan Aequorea victoria, yo te fouye nan spectre fragman peptid yo pou sekans kanonik ak sekans izofòm pwoteyòm referans sourit la (ID Pwoteyòm UP000000589, telechaje nan UniProt an Me 2017). Oksidasyon metyonin ak asetilasyon N-tèminal pwoteyin yo te fikse kòm modifikasyon varyab; metilasyon karbamoyil sistin te fikse kòm modifikasyon fiks. Paramèt dijesyon yo fikse sou "espesifikite" ak "tripsin/P". Kantite minimòm peptid ak peptid razwa ki itilize pou idantifikasyon pwoteyin se 1; kantite minimòm peptid inik se 0. Anba kondisyon matche kat peptid la, to idantifikasyon pwoteyin lan te 0.01. Opsyon "Dezyèm Peptid" la aktive. Sèvi ak opsyon "match between runs" la pou transfere idantifikasyon reyisi ant diferan fichye orijinal yo. Sèvi ak LFQ minimòm rapò konte 1 pou kantifikasyon san etikèt (LFQ) (60). Entansite LFQ a filtre pou omwen de valè valab nan omwen yon gwoup jenotip nan chak pwen tan, epi li ekstrapole soti nan yon distribisyon nòmal ak yon lajè .0.3 epi desann 1.8. Sèvi ak platfòm enfòmatik Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ak R (https://r-project.org/) pou analize rezilta LFQ yo. Yo te itilize yon tès t modere bidireksyonèl nan pake lojisyèl limma a pou analiz ekspresyon diferansyèl (61). Yo fè analiz done eksploratwa lè l sèvi avèk ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ak pheatmap. Yo te analize done pwoteyomik ki baze sou TMT yo lè l sèvi avèk MaxQuant vèsyon 1.6.10.43. Chèche done pwoteyomik brit nan baz done pwoteyomik imen UniProt la, ki te telechaje an Septanm 2018. Analiz la gen ladan faktè koreksyon pite izotòp ki te bay pa manifakti a. Sèvi ak limma nan R pou analiz ekspresyon diferansyèl. Done orijinal yo, rezilta rechèch baz done a, ak workflow analiz done yo ak rezilta yo tout estoke nan alyans ProteomeXchange la atravè depo patnè PRIDE la ak idantifikatè seri done PXD019690.
Anotasyon fonksyonèl yo anrichi analiz la. Yo te itilize zouti Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) pou detèmine richès tèm anotasyon fonksyonèl seri done yo a 8 semèn (Figi 1). An brèf, yo itilize lis pwoteyin kantitatif ki jwenn nan analiz done LC-MS/MS (tandem mas spectrometris) avèk kritè filtè sa yo: Yo chwazi Mus musculus kòm espès ak background, epi kategori a montre valè P ajiste pa Benjamini pou anrichisman 0.05 oswa pi ba konsidere kòm siyifikatif. Pou graf sa a, yo montre senk kategori depase ki pi wo yo nan chak gwoup ki baze sou valè P ajiste a. Lè l sèvi avèk plizyè tès t, lè l sèvi avèk pwogram ogmantasyon lineyè de etap Benjamini, Krieger, ak Yekutieli (Q = 5%), yo fè analiz ekspresyon pwoteyin sou kou tan sou kandida enpòtan yo idantifye nan chak kategori, epi yo analize chak ranje separeman. Pa gen okenn nesesite pou adopte yon SD konsistan.
Pou nou te kapab konpare rezilta etid sa a ak baz done ki te pibliye yo epi jenere yon dyagram Venn nan Figi 1, nou te konbine lis pwoteyin kantitatif la ak anotasyon MitoCarta 2.0 yo (24). Sèvi ak zouti sou entènèt Desen dyagram Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) pou jenere dyagram nan.
Pou jwenn enfòmasyon detaye sou pwosedi estatistik yo itilize pou analiz pwoteyomik, tanpri al gade seksyon ki koresponn lan nan Materyèl ak Metòd. Pou tout lòt eksperyans yo, ou ka jwenn enfòmasyon detaye nan lejann ki koresponn lan. Sòf si yo presize otreman, tout done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM, epi tout analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism 8.1.2.
Pou plis materyèl pou atik sa a, tanpri gade http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Sa a se yon atik aksè ouvè distribye anba kondisyon Lisans Atribisyon-Non-Komèsyal Creative Commons lan, ki pèmèt itilizasyon, distribisyon ak repwodiksyon nan nenpòt mwayen, depi itilizasyon final la pa pou benefis komèsyal epi prensip la se ke travay orijinal la kòrèk. Referans.
Nòt: Nou sèlman mande w pou w bay adrès imel ou pou moun ou rekòmande sou paj la ka konnen ou vle yo wè imel la epi li pa spam. Nou p ap pran okenn adrès imel.
Kesyon sa a sèvi pou teste si ou se yon vizitè epi pou anpeche soumèt spam otomatik.
Pa E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analiz pwoteyomik newòn disfonksyonèl yo revele ke pwogram metabolik yo aktive pou konbat newodejenerasyon.
Pa E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analiz pwoteyomik newòn disfonksyonèl yo revele ke pwogram metabolik yo aktive pou konbat newodejenerasyon.
©2020 Asosyasyon Ameriken pou Avansman Syans. tout dwa rezève. AAAS se yon patnè HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ak COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.