Prezan†Adrès aktyèl: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Konplèks rekòlte limyè sant reyaksyon 1 (RC-LH1) la se eleman fotosentetik prensipal bakteri fototwofik mov yo. Nou te prezante de estrikti mikwoskopi kriyo-elektwon nan konplèks RC-LH1 ki soti nan Rhodopseudomonas palustris. Estrikti rezolisyon 2.65 Å nan konplèks RC-LH114-W la konsiste de 14 bouk sou-inite LH1 ki antoure RC, ki koupe pa pwoteyin W, alòske konplèks san pwoteyin-W la konplètman antoure pa RC nan konpozisyon RC. Bouk LH1 16 sou-inite fèmen. Konparezon estrikti sa yo bay enfòmasyon sou dinamik kinòn nan konplèks RC-LH1 la, ki gen ladan chanjman konfòmasyon ki pa te detèmine anvan lè kinòn lye nan sit RC QB a, ansanm ak kote sit lyezon kinòn oksilyè yo, ki ede pase yo nan RC. Estrikti inik pwoteyin W la anpeche fèmti bouk LH1 la, kidonk kreye yon kanal pou akselere echanj kinòn/kinolòn lan.
Enèji fotosentèz bay la ka soutni prèske tout lavi sou latè, epi li gen yon gwo potansyèl pou byoteknoloji solè. Pandan y ap ankouraje fotosentèz mondyal, bakteri fototwofik mov yo montre tou divès mòd enèji ak kapasite metabolik. Yo ka evite fotosentèz epi grandi kòm bakteri etewotwofik nan fènwa, yo ka fikse azòt ak diyoksid kabòn, pwodui idwojèn, epi degrade konpoze aromatik (1-3). Pou bay enèji pou pwosesis sa yo, limyè dwe konvèti rapidman epi avèk efikasite an enèji chimik. Pwosesis sa a kòmanse lè konplèks antèn ki pyèje limyè a absòbe limyè epi transfere enèji ki pyèje a nan sant reyaksyon an (RC), kidonk kòmanse separasyon chaj (4 - 7). Inite debaz fotosentèz nan bakteri fototwofik mov yo konpoze de RC tip 2, ki antoure pa konplèks rekòlte limyè 1 (LH1), ki fòme konplèks nwayo RC-LH1 la. LH1 fòme pa yon seri eterodimè αβ koube, chak nan yo mare de molekil klowofil bakteri (BChl) a ak youn oubyen de karotenoyid (8-12). Antèn LH1 ki pi senp lan gen ladan l 16 oubyen 17 eterodimè αβ ki antoure RC (9-13) nan yon bouk fèmen, men nan lòt konplèks santral yo, peptid transmembranè yo entèwonp kontinwite LH1 ki antoure a, kidonk sa ankouraje difizyon kinòl/kinòn ant RC ak konplèks sitokrom bc1 la (11, 13-15). Plant fototwofik mov Rhodopseudomonas (Rps.) la se yon òganis modèl ki ka konprann transfè enèji ak elektwon ki sipòte fotosentèz la. Premye estrikti kristal Rps la. Modèl konplèks palustris RC-LH1 la se RC, ki antoure pa 15 bouk LH1 eterodimèrik, ki entèwonp pa yon pwoteyin enkoni yo rele "Pwoteyin W" (14). Pwoteyin-W te idantifye apre sa kòm RPA4402, ki se yon pwoteyin 10.5kDa ki pa karakterize ak twa elis transmembranè (TMH) prevwa (16). Nou pwopoze pou chanje non jèn rpa4402 ki kode pwoteyin W la an pufW pou l ka koresponn ak nomenklatur yo itilize pou jèn ki kode sou-inite RC-L, M (pufL, pufM) ak LH1α, β (pufA, pufB). Sa ki enteresan, pwoteyin-W la sèlman prezan nan anviwon 10% nan RC-LH1, sa ki revele ke Rps. palustris pwodui de konplèks RC-LH1 diferan. La a, nou rapòte estrikti cryo-EM (cryo-EM) wo rezolisyon pou de konplèks debaz yo, youn ak pwoteyin W ak 14 eterodimè αβ, lòt la san pwoteyin W ak yon bouk fèmen ak 16 eterodimè LH1. Estrikti nou an reprezante yon chanjman radikal nan konpreyansyon konplèks RC-LH1 Rps. palustris la, paske nou te analize popilasyon omojèn chak varyant epi nou gen ase rezolisyon pou nou byen asiyen chak peptid ak pigman ki lye ak lipid ak kinòn ki gen rapò. Konparezon estrikti sa yo montre ke twa pwoteyin TMH-W yo, ke yo pa jwenn nan okenn lòt konplèks RC-LH1 jiskaprezan, jenere yon kanal kinòn pou akselere echanj kinòn/kinolòn lan. Yo idantifye yon kantite sit lyezon lipid ak kinòn konsève, epi nou revele yon nouvo chanjman konfòmasyon apre konbinezon kinòn ak RC a, ki ka apwopriye pou fotosistèm II (PSII) RC nan òganis fototwofik oksijene yo. Rezilta nou yo bay nouvo enfòmasyon sou sinetik lyezon ak echanj kinòn/kinolòn nan konplèks santral RC-LH1 bakteri fototwofik mov yo.
Pou fasilite yon etid detaye sou de konplèks yo jwenn nan Rps. palustris, nou izole chak RC-LH1 pa metòd byochimik. Konplèks ki manke pwoteyin W la (ki rele apre sa ΔpufW) te pirifye nan souch ki pa gen jèn pufW la (16), epi se sèlman yon sèl konplèks RC-LH1 ki ka pwodui. Konplèks ki gen pwoteyin W la pwodui pa yon souch. Pwoteyin W nan souch sa a modifye ak yon etikèt 10x His nan C-tèminal li, pou konplèks ki gen pwoteyin W la ka konbine efektivman ak pifò pwoteyin W ki manke yo lè yo imobilize metal la. Konplèks la separe efektivman (16) Kromatografi Afinite (IMAC).
Jan yo montre nan Figi 1, tou de konplèks yo genyen yon RC twa sou-inite (RC-L, RC-M ak RC-H) ki antoure pa yon antèn LH1. Estrikti 2.80-A nan konplèks ki pa gen pwoteyin-W la montre 16 eterodimè αβ, ki fòme yon bouk LH1 fèmen ki antoure nèt RC a, ke nou pral rele konplèks RC-LH116 apre sa. Estrikti 2.65Å nan konplèks ki gen pwoteyin-W la gen yon 14-etewodimè LH1 ki koupe pa pwoteyin-W, ke nou pral rele RC-LH114-W apre sa.
(A ak B) Reprezantasyon sifas konpoze a. (C ak D) Pigman lye yo eksprime nan baton. (E ak F) Konplèks yo obsève nan sifas sitoplasmik la gen peptid yo ak sou-inite LH1 yo reprezante nan desen anime, epi yo nimewote nan sans zegwi mont lan apati espas pwoteyin-W la [ki konsistan avèk nimero Rba. konplèks sphaeroides (13)]. Pou LH1-α, koulè sou-inite pwoteyin lan se jòn; pou LH1-β, koulè sou-inite pwoteyin lan se ble; pou pwoteyin-W, pwoteyin lan se wouj; pou RC-H, li se syan; pou RC-L, li se zoranj; pou RC-M, magenta. Kofaktè yo reprezante pa baton, vèt reprezante molekil BChl ak BPh a, koulè mov reprezante karotenoid, epi jòn reprezante molekil UQ10. (G ak H) View agrandi espas pwoteyin-W la nan rejyon ekivalan konplèks RC-LH114-W (G) ak konplèks RC-LH116 (H). Kofaktè yo parèt sou fòm ranpli espas, kinòn chelate a parèt an ble. Espas pwoteyin-W la make ak yon liy ble tire nan (G), epi ti twou kote kinòn/kinolòl la difize sou bag LH116 la make ak yon liy nwa tire nan (H).
Figi 1 (A ak B) montre RC a ki antoure pa etalaj ouvè oswa fèmen eterodimè LH1αβ, chak nan yo mare de BChl ak yon karotenoid (Figi 1, C ak D). Etid anvan yo te montre ke Rps se konplèks LH1 la. Nan chemen byosentèz ksantin spirulina a, espès sa yo gen popilasyon karotenoid melanje (17). Sepandan, spiropiroksantin se karotenoid dominan an epi dansite li satisfezan. Se poutèt sa, nou te chwazi pou modle spiroksantin nan tout sit lyezon LH1 yo. Polipeptid alfa ak beta yo se TMH endividyèl ak rejyon ekstèn manbràn kout (Figi 1, A, B, E, ak F). Malgre ke dansite 17 rezidi nan C-tèminal la pa te obsève, polipeptid alfa a te fann soti nan Met1 rive nan Ala46 nan tou de konplèks yo. Polipeptid β a te redwi soti nan Gly4 rive nan Tyr52 nan RC-LH116, epi soti nan Ser5 rive nan Tyr52 nan RC-LH114-W. Yo pa obsève okenn dansite 3 ou 4 rezidi N-tèminal oubyen 13 rezidi C-tèminal (Figi S1). Analiz espektwometri mas konplèks RC-LH1 melanje ki prepare apati souch sovaj la te montre ke rejyon ki manke a se rezilta klivaj etewojèn peptid sa yo (Figi S1 ak S2). Yo te obsève tou formilasyon N-tèminal α-Met1 la (f). Analiz la te montre ke α-peptid la konsiste de rezidi fMet1 rive Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, epi β-peptid la konsiste de rezidi Ser2 rive Ala53, ki an bon akò ak kat dansite EM tanperati ba a.
Kowòdinasyon α-His29 ak β-His36 fè BChls yo fasafas; chak eterodimè αβ reyini ak vwazen li yo pou fòme yon bouk ouvè (RC-LH114-W) oswa yon bouk fèmen (RC-LH116) otou seri pigman ki konekte ak eksiton RC a (Figi 1, C ak D). Konpare ak bann 877 nm RC-LH114-W a, deplasman wouj absòpsyon 880 nm RC-LH116 la se 3 nm (Figi 2A). Sepandan, spectre dikroism sikilè a prèske menm jan an (Figi 2B), sa ki endike ke byenke gen yon diferans klè ant bouk ouvè ak bouk fèmen, anviwònman lokal BChls yo trè menm jan an. Deplasman wouj absòpsyon an ka rezilta yon rediksyon nan mouvman tèmik ak yon ogmantasyon nan estabilite sou bouk fèmen an (18, 19), chanjman nan kouplaj pigman ki koze pa bouk fèmen an (20, 21), oswa yon konbinezon de de efè sa yo (11).
(A) Espèk absòpsyon iltravyolèt/vizib/toupre enfrawouj, pik yo make ak pigman korespondan yo epi yo nòmalize ak pik BPh a nan 775 nm. (B) Espèk dikroism sikilè nòmalize ak absòbans BChl nan 805 nm. (C ak D) Espèk ΔA chwazi nan espèk absòpsyon rezoud nan tan konplèks RC-LH114-W (C) ak konplèks RC-LH116 (D). Pou pi bon konparezon, tout espèk yo nòmalize ak ∆A nan −A a 0.2 ps. (E) Vitès oksidasyon sitokwòm c2 apre iradyasyon an prezans divès konsantrasyon UQ2 (gade Figi S8 pou done brit). (F) Nan selil ki grandi anba limyè entansite fèb, mwayen oswa wo (10, 30 oswa 300μMm-2 s-1, respektivman), sou-inite pwoteyin W ak RC-L nan konplèks pirifye a ak rapò manbràn separe a. Detèmine nivo pwoteyin nan pa elektwoforèz jèl SDS-poliakrilamid ak imunotès (gade Figi S9 pou done brit yo). Detèmine rapò a parapò ak konplèks RC-LH114-W pirifye a. Rapò stokiyometrik RC-L ak pwoteyin-W nan konplèks la se 1:1.
BChl yo nan pozisyon 1 nan bouk αβ14 defòme RC-LH114-W la (Figi 1, A, C, ak E) pi pre donatè prensipal RC a (P) pa 6.8 Å pase BChl ekivalan yo nan RC-LH116 (Figi 1, B, D, ak F, ak Figi S3); sepandan, sinetik absòpsyon tranzitwa de konplèks yo montre ke pou RC-LH114-W ak RC-LH116, konstan tan transfè enèji eksitasyon yo soti nan LH1 rive nan RC se 40 ±4 ak 44 ±3 ps (Figi 2). , C ak D, Figi S4 ak Tablo S2). Pa gen okenn diferans siyifikatif tou nan transfè elektwonik nan RC (Figi S5 ak tèks siplemantè ki gen rapò). Nou sispèk ke korespondans sere tan transfè enèji ant LH1 ak RC-P a se akòz distans, ang ak enèji potansyèl ki sanble nan pifò BChl nan de bouk LH1 yo. Li sanble ke eksplore modèl enèji LH1 la pou rive nan distans minimòm lan pa pi rapid pase transfè enèji dirèk soti nan sit ki pa optimal yo rive nan RC. Bouk LH1 ouvè nan RC-LH114-W la kapab sibi tou yon mouvman tèmik ensiyifyan anba kondisyon tanperati ki ba pou analiz estriktirèl, epi gen yon konfòmasyon bag αβ14 ki pi long nan tanperati chanm nan apati distans pigmantasyon βBChls nan pozisyon RC 1.
Konplèks RC-LH116 la gen 32 BChls ak 16 karotenoyid, epi aranjman jeneral li se menm jan ak sa yo jwenn nan Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), souch Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) ak alg vèt (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Apre aliyman, se sèlman ti devyasyon nan pozisyon eterodimè αβ yo te obsève, espesyalman 1-5, 15, ak 16 (Figi S6). Prezans pwoteyin-W la gen yon enpak siyifikatif sou estrikti LH1. Twa TMH li yo konekte pa bouk kout, ak N-tèminal la sou bò lumen konplèks la ak C-tèminal la sou bò sitoplasmik la (Figi 1A ak 3, A rive D). Pwoteyin-W la lajman idrofob (Figi 3B), epi TMH2 ak TMH3 kominike avèk LH1αβ-14 pou fòme yon sifas transmembranè (Figi 3, B ak E rive G). Entèfas la konpoze sitou de rezidi Phe, Leu ak Val nan rejyon transmembranè a. Rezidi sa yo anpile ak asid amine idrofob ak pigman αβ-14. Gen kèk rezidi polè ki kontribye tou nan entèraksyon an, tankou lyezon idwojèn ant W-Thr68 ak β-Trp42 sou sifas kavite konplèks la (Figi 3, F ak G). Sou sifas sitoplas la, Gln34 adjasan a gwoup keto karotenoid αβ-14 yo. Anplis de sa, molekil n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) la te rezoud, epi ke idrofob li a te pwolonje nan koòdone ant pwoteyin-W ak αβ-14, epi ke lipid la ka sitiye nan kò a. Nou te remake tou ke rejyon rezolisyon C-terminal pwoteyin W ak RCH yo trè pre, men yo pa nan kad fòmasyon entèraksyon espesifik (Figi 1, A ak E). Sepandan, ka gen entèraksyon nan asid amine C-terminal ki pa rezoud nan de pwoteyin sa yo, sa ki ka bay yon mekanis pou rekritman pwoteyin-W pandan asanblaj konplèks RC-LH114-W la.
(A) Pwoteyin-W, ki fè fas ak entèfas LH1αβ14 la nan fòm desen anime, gen yon chèn lateral ki gen fòm baton (wouj), ki parèt nan yon pati nan dyagram potansyèl elektwostatik la (sifas gri transparan ak yon nivo kontou 0.13). (B) Pwoteyin-W reprezante pa yon sifas ki gen koulè idrofob. Zòn polè ak chaje yo parèt an syan, zòn idrofob yo parèt an blan, epi zòn ki fòtman idrofob yo parèt an zoranj. (C ak D) Pwoteyin-W reprezante nan desen anime, oryantasyon li se menm jan ak nan (A) (C), epi li vire pa 180° (D). Selon pozisyon nan sekans lan, rezidi distenge yo adopte yon chema koulè lakansyèl, kote N-tèminal la ble ak C-tèminal la wouj. (E) Pwoteyin-W nan menm vi ak nan (A), epi rezidi yo nan entèfas pwoteyin-W:LH1 yo reprezante pa baton ak mak tache. (F) Pwoteyin-W la vire 90° parapò ak (E) ak LH1αβ14 nan reprezantasyon desen anime a, epi parapò ak rezidi entèfas yo nan reprezantasyon ba a. Rezidi ki pandye nan polipeptid beta a make. Kofaktè a montre kòm yon ba ki koresponn ak koulè Figi 1 an, β-DDM dekonpoze a montre an gri, epi oksijèn nan montre an wouj. (G) View nan (F) la vire 180°, ak rezidi polipeptid alfa ki make a ki vizib yo.
Pwoteyin-W ranplase yon eterodimè αβ (15yèm lan nan Figi 1F), kidonk anpeche fèmti bouk la epi enkline twa premye eterodimè αβ yo. Yo te obsève ke ang enklinasyon maksimòm premye eterodimè αβ-1 la parapò ak nòmal fim nan te 25° a 29° (Figi 1, A ak E), ki te fòme pa enklinasyon 2° a 8° αβ-1 nan RC A byen file kontras-LH116 (Figi 1, B ak F). Dezyèm ak twazyèm eterodimè yo enkline a 12° a 22° ak 5° a 10°, respektivman. Akòz antrav sterik RC a, enklinasyon αβ-1 la pa enkli dezyèm pè αβ a (ki koresponn ak 16yèm αβ a nan Figi 1F), kidonk fòme yon espas klè nan bag LH1 la (Figi 1, A ak E). Akòz absans de eterodimè αβ, akonpaye pa pèt kat BChl ak de karotenoid, okenn nan karotenoid yo pa mare ak sou-inite αβ-1 trese a, sa ki lakòz yon bag LH114-W ki gen 13 karotenoid Vejetaryen ak 28 BChl. Estimasyon rezolisyon lokal de konplèks yo nan rejyon αβ1 a 7 yo pi ba pase sa yo ki nan rès bouk LH1 la, sa ki ka reflete plastisite natirèl sou-inite LH1 ki adjasan a sit RC QB a (Figi 4).
Foto RC-LH114-W (A ak B) ak RC-LH116 (C ak D) yo montre apati menm vi anwo/vi bò (A ak B) (A ak C) ak sifas kavite nan Fig. 1. (B ak D). Kle koulè yo montre adwat la.
Sèl lòt konplèks nwayo karakteristik ki gen yon rapò stokiyometrik 1:14 se dimè Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX la (13). Sepandan, pwoteyin W ak PufX pa gen okenn omoloji evidan, epi yo gen yon enpak siyifikatif sou estrikti LH1 respektif yo. PufX se yon sèl TMH ak yon domèn sitoplasmik N-tèminal ki kominike avèk bò sitoplasmik sou-inite RC-H la (13) nan yon pozisyon ki koresponn ak Rps. palustris LH116αβ-16. PufX kreye yon kanal pou echanj kinòn/kinolòn ant RC-LH1 ak konplèks sitokrom bcl la epi li prezan nan tout konplèks nwayo Rba. sphaeroides la (13). Malgre ke koòdone monomè-monomè a nan Rba. Dimè sphaeroides RC-LH1-PufX la sitiye nan pozisyon lyezon pwoteyin W nan RC-LH114-W, epi espas ki pwovoke pa PufX ak pwoteyin-W a nan yon pozisyon ekivalan (Figi S7A). Espas ki nan RC-LH114-W a aliyen tou ak kanal kinòn ipotetik (8) Pseudomonas rosea LH1 la, ki fòme pa peptid ki pa gen rapò ak pwoteyin W oswa PufX (Figi S7B). Anplis de sa, kanal kinòn nan Blc. LH1 vèt emwòd ki fòme lè yo eskli yon sou-inite γ (7) sitiye nan yon pozisyon ki sanble (Figi S7C). Malgre ke medyatè pa diferan pwoteyin, aparans kanal kinòn/kinolòl sa yo nan yon pozisyon komen nan konplèks RC-LH1 la sanble yon egzanp evolisyon konvèjan, ki endike ke espas ki kreye pa pwoteyin W la ka aji kòm yon kanal kinòn.
Espas ki nan bouk LH114-W a pèmèt fòmasyon yon rejyon manbràn kontinyèl ant espas entèn konplèks RC-LH114-W a ak manbràn jeneral la (Figi 1G), olye ke konekte de domèn yo atravè yon pò pwoteyin tankou nan pwoteyin yo. Konplèks RC-LH116 la sanble ak yon konplèks fèmen ki sanble ak yon zegwi Tch. (22) (Figi 1H). Piske difizyon kinòn nan manbràn nan pi rapid pase difizyon nan kanal pwoteyin etwat la, bouk LH114-W ouvè a ka pèmèt yon woulman RC pi rapid pase bouk LH116 fèmen an, epi difizyon kinòn nan RC a ka pi limite. Pou nou teste si pwoteyin W afekte konvèsyon kinòn yo atravè RC, nou te fè yon tès oksidasyon sitokwòm sou yon sèten konsantrasyon ubikinòn 2 (UQ2) (yon analòg UQ10 natirèl ak yon ke izoprèn ki pi kout) (Figi 2E). Malgre prezans kinòn kelate anpeche detèminasyon egzak konstan Michaelis aparan an (RC-LH114-W ak RC-LH116 yo apwopriye pou 0.2±0.1μM ak 0.5±0.2μM, respektivman), vitès maksimòm RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) se 28±5% pi gwo pase RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Okòmansman, nou te estime ke pwoteyin-W prezan nan apeprè 10% nan konplèks prensipal la (16); isit la, to okipasyon selil kwasans ki gen ti limyè, limyè mwayen, ak limyè fò yo se 15 ± 0.6%, 11 ± 1% ak 0.9 ± 0.5% respektivman (Figi 2F). Konparezon kantitatif espektwometri mas la te montre ke adisyon etikèt istidin lan pa t diminye abondans relatif pwoteyin-W konpare ak souch sovaj yo (P = 0.59), kidonk nivo sa yo pa yon atifak pwoteyin-W modifye (Figi S10). Sepandan, okipasyon pwoteyin-W ki ba sa a nan konplèks RC-LH1 la ka pèmèt kèk RC yo chanje nan yon vitès akselere, kidonk diminye echanj kinòn/kinolòn ki pi dousman nan konplèks RC-LH116 la. Nou te remake ke to okipasyon limyè ki wo a pa konsistan avèk done transkriptomik resan yo, ki endike ke ekspresyon jèn pufW ogmante anba limyè fò (Figi S11) (23). Diferans ki genyen ant transkripsyon pufW ak enkòporasyon pwoteyin-W nan konplèks RC-LH1 la se konfizyon epi li ka reflete règleman konplèks pwoteyin nan.
Nan RC-LH114-W, 6 kadyolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliseròl (POPG) ak 29 molekil β-DDM yo plase epi modle ladan l: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ak 12 βDDM. RC-LH116 (Figi 5, A ak B). Nan de estrikti sa yo, CDL prèske sitiye sou bò sitoplasmik konplèks la, alòske POPC, POPG ak β-DDM yo sitou sitiye sou bò luminal la. De molekil lipid ak detèjan te izole nan rejyon αβ-1 rive αβ-6 nan konplèks RC-LH114-W la (Figi 5A), epi senk te izole nan rejyon ekivalan RC-LH116 la (Figi 5B). Yo te jwenn plis lipid sou lòt bò konplèks la, sitou CDL, akimile ant RC ak αβ-7 rive αβ-13 (Figi 5, A ak B). Lòt lipid ak detèjan ki byen rezoud estriktirèlman yo sitiye deyò bag LH1 la, epi chenn asil ki byen rezoud yo pwolonje ant sou-inite LH1 yo, ke yo deziyen tantativman kòm β-DDM nan RC-LH114-W, epi yo defini kòm β-DDM nan RC Yon melanj β-DDM ak POPC-LH116. Pozisyon ki sanble ak lipid ak detèjan kelatan yo nan estrikti nou an endike ke yo se sit lyezon ki enpòtan fizyolojikman (Figi S12A). Pozisyon molekil ekivalan yo nan Tch yo gen bon konsistans tou. Dous ak Trv. Souch 970 RC-LH1 yo (Figi S12, B rive E) (9, 12) ak rezidi lyezon idwojèn nan gwoup tèt lipid la te montre yon konsèvasyon ki jistis bon nan aliyman sekans lan (Figi S13), sa ki endike ke CDL konsève ki mare ak RC (24), sit sa yo ka konsève nan konplèks RC-LH1 la.
(A ak B) Peptid RC-LH114-W (A) ak RC-LH116 (B) yo reprezante pa desen anime, epi pigman yo reprezante pa baton, lè l sèvi avèk konbinezon koulè ki nan Figi 1. Lipid yo montre an wouj, epi detèjan yo montre an gri. UQ ki lye ak sit RC QA ak QB yo jòn, alòske UQ izole a ble. (C ak D) Menm vi ak (A) ak (B), san lipid yo. (E rive G) Vi agrandi Q1(E), Q2(F) ak Q3(G) ki soti nan RC-LH116, ak chenn lateral ki enfliyanse youn lòt. Lyen idwojèn yo montre kòm liy tire nwa.
Nan RC-LH116, tou de RC QA ak QB UQ, ki patisipe nan transfè elektwon nan pwosesis separasyon chaj la, dekonpoze nan sit lyezon yo. Sepandan, nan RC-LH114-W, kinòn QB a pa te rezoud epi nou pral diskite sa an detay anba a. Anplis kinòn QA ak QB yo, de molekil UQ kelate (ki sitiye ant bag RC ak LH1 yo) yo asiyen nan estrikti RC-LH114-W la dapre gwoup tèt byen rezoud yo (ki sitiye nan Q1 ak Q2, respektivman). Figi 5C). De inite izoprèn yo asiyen nan Q1, epi kat dansite a rezoud 10 ke izoprèn konplè Q2 yo. Nan estrikti RC-LH116 la, twa molekil UQ10 kelate (Q1 a Q3, Figi 5D) te rezoud, epi tout molekil yo gen yon dansite klè nan tout ke a (Figi 5, D a G). Nan de estrikti yo, pozisyon gwoup tèt kinòn Q1 ak Q2 yo gen yon ekselan konsistans (Figi S12F), epi yo sèlman kominike avèk RC. Q1 sitiye nan antre espas W RC-LH114-W la (Figi 1G ak 5, C, D ak E), epi Q2 sitiye toupre sit lyezon QB a (Figi 5, C, D) ak F). Rezid L-Trp143 ak L-Trp269 konsève yo trè pre Q1 ak Q2 epi yo bay potansyèl entèraksyon π-anpile (Figi 5, E ak F, ak Figi S12). L-Gln88, 3.0 Å soti nan oksijèn distal Q1 la, bay yon lyezon idwojèn solid (Figi 5E); rezidi sa a konsève nan tout RC yo eksepte relasyon ki pi lwen an (Figi S13). L-Ser91 ranplase Thr yon fason konsèvatif nan pifò lòt RC yo (Figi S13), li sitiye a 3.8 Angstrom de oksijèn metil Q1 la, epi li ka bay lyezon idwojèn fèb (Figi 5E). Q3 pa sanble gen yon entèraksyon espesifik, men li sitiye nan rejyon idrofob ant sou-inite RC-M lan ak sou-inite LH1-α 5 a 6 (Figi 5, D ak G). Q1, Q2 ak Q3 oubyen kinòn kelate ki toupre yo te rezoud tou nan Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ak Blc. Estrikti iris la (9, 10, 12) endike yon sit lyezon kinòn oksilyè konsève nan konplèks RC-LH1 la (Figi S12G). Senk UQ dekonpoze nan RC-LH116 yo an bon akò ak 5.8±0.7 nan chak konplèks detèmine pa kromatografi likid pèfòmans segondè (HPLC), alòske twa UQ dekonpoze nan RC-LH114-W yo pi ba pase Valè mezire 6.2±0.3 la (Fig. S14) endike ke gen molekil UQ ki pa rezoud nan estrikti a.
Polipeptid pseudo-simetrik L ak M yo chak gen senk TMH epi yo fòme yon eterodimè ki konbine yon dimè BChl, de monomè BChl, de monomè bakteriofaj (BPh), ak yon fè ki pa èm ak youn oubyen de molekil UQ10. Atravè prezans lyezon idwojèn sou gwoup ketòn tèminal la ak akimilasyon li te ye nan Rps, karotenoid yo enkòpore nan sou-inite M lan, ke yo rele cis-3,4-deidroodopin. Espès (25). Domèn manbràn ekstèn RC-H la ankre nan manbràn lan pa yon sèl TMH. Estrikti RC jeneral la sanble ak twa sou-inite RC nan espès ki gen rapò (tankou Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrosikl BChl ak BPh yo, zo rèl karotenoid la ak fè ki pa èm nan sipèpoze nan seri rezolisyon estrikti sa yo, menm jan ak gwoup tèt UQ10 nan sit QA a ak kinòn QB nan RC-LH116 (Figi S15).
Disponibilite de estrikti RC ak diferan to okipasyon sit QB bay yon nouvo opòtinite pou egzamine chanjman konfòmasyon konsistan ki akonpaye lyezon kinòn QB. Nan konplèks RC-LH116 la, kinòn QB a sitiye nan pozisyon "pwoksimal" ki konplètman lye a (26), men separasyon RC-LH114-W la pa gen kinòn QB. Pa gen okenn kinòn QB nan RC-LH114-W, sa ki etonan paske konplèks la aktif, plis pase konplèks RC-LH116 la ak kinòn QB ki rezoud estriktirèlman. Malgre ke de bag LH1 yo chelate anviwon sis kinòn, senk rezoud estriktirèlman nan bag RC-LH116 fèmen an, pandan ke sèlman twa limite estriktirèlman nan bag RC-LH114-W ouvè a. Dezòd estriktirèl sa a ki ogmante ka reflete ranplasman pi rapid sit QB RC-LH114-W yo, sinetik kinòn ki pi rapid nan konplèks la, ak ogmantasyon chans pou travèse bouk LH1 la. Nou sijere ke mank UQ nan sit RC QB RC-LH114-W a ta ka rezilta yon konplèks ki pi konplèks e ki pi aktif, epi sit QB RC-LH114-W a te imedyatman bloke nan woulman UQ. Etap espesifik la (antre nan sit QB a te fèmen) reflete konformasyon aktivite sa a.
San QB, wotasyon L-Phe217 ki akonpaye a nan yon pozisyon ki pa konpatib ak lyezon UQ10, paske sa pral lakòz yon kolizyon espasyal ak premye inite izoprèn nan ke a (Figi 6A). Anplis de sa, prensipal chanjman konfòmasyon evidan yo evidan, espesyalman elik de a (ti elik nan bouk ant TMH D ak E) kote L-Phe217 deplase nan pòch lyezon QB a ak wotasyon L-Tyr223 (Figi 6A) pou kraze lyezon idwojèn nan ak kad M-Asp45 la epi fèmen antre sit lyezon QB a (Figi 6B). Elik de a pivote nan baz li, Cα L-Ser209 la deplase pa 0.33 Å, pandan ke L-Val221Cα a deplase pa 3.52 Å. Pa gen okenn chanjman obsèvab nan TMH D ak E, ki sipèpoze nan tou de estrikti yo (Figi 6A). Nan sa nou konnen, sa a se premye estrikti nan RC natirèl la ki fèmen sit QB a. Yon konparezon ak estrikti konplè a (ki lye ak QB) montre ke anvan kinòn nan redwi, yon chanjman konfòmasyon nesesè pou fè l antre nan kinòn nan. L-Phe217 vire pou fòme yon entèraksyon π-anpile ak gwoup tèt kinòn nan, epi eliks la deplase deyò, sa ki pèmèt skelèt L-Gly222 ak chèn lateral L-Tyr223 fòme yon rezo lyezon idwojèn ak yon estrikti lyezon idwojèn ki estab (Figi 6, A ak C).
(A) Desen anime ologram (chèn L, chèn zoranj/M, magenta) ak estrikti apo (gri) ki sipèpoze, kote rezidi kle yo parèt sou fòm yon reprezantasyon ki sanble ak yon baton. UQ10 reprezante pa yon ba jòn. Liy pwentiye a endike lyezon idwojèn ki fòme nan tout estrikti a. (B ak C) Reprezantasyon sifas apolipoprotein nan ak tout estrikti bag la, mete aksan sou oksijèn chèn lateral L-Phe217 an ble ak L-Tyr223 an wouj, respektivman. Sou-inite L la zoranj; sou-inite M ak H yo pa gen koulè. (D ak E) Apolipoprotein (D) ak tout (E) sit RC QB [kolorye pa (A) respektivman] ak Thermophilus thermophilus PSII (vèt, ble ak kinòn plastik; PDB ID: 3WU2) Aliyen (58).
Sanzatann, byenke plizyè estrikti RC ki defisyan an QB san LH1 disponib, chanjman konfòmasyonèl yo obsève nan etid sa a pa t rapòte anvan. Sa yo enkli estrikti rediksyon QB ki soti nan Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ak Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), yo tout prèske menm jan ak estrikti QB jeneral yo. Yon enspeksyon apwofondi nan 3PRC te revele ke molekil detèjan LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) mare nan antre pozisyon QB a, sa ki ka anpeche rearanjman nan yon konfòmasyon fèmen. Malgre ke LDAO pa dekonpoze nan menm pozisyon an nan 1EYS oswa 1OGV, RC sa yo prepare lè l sèvi avèk menm detèjan an e pakonsekan yo ka pwodui menm efè a. Estrikti kristal Rba a. Sphaeroides RC ko-kristalize avèk sitokwòm c2 (PDB ID: 1L9B) sanble gen yon sit QB fèmen tou. Sepandan, nan ka sa a, rejyon N-tèminal polipeptid RC-M lan (ki kominike avèk sit lyezon QB a atravè lyezon H rezidi Tyr la sou eliks Q a) adopte yon konformasyon ki pa natirèl, epi chanjman konformasyon QB a pa eksplore pi lwen (30). Sa ki rasire se ke nou pa wè kalite defòmasyon sa a nan polipeptid M lan nan estrikti RC-LH114-W la, ki prèske menm jan ak rejyon N-tèminal RC-LH116 la. Li ta dwe note tou ke apre eliminasyon antèn LH1 ki baze sou detèjan an, apolipoprotein RC yo nan PDB a te rezoud, sa ki te elimine pisin kinòn entèn yo ak lipid yo nan espas ki genyen ant RC a ak sifas enteryè bag LH1 ki antoure a (31, 32). RC rete fonksyonèl paske li kenbe tout kofaktè yo, eksepte kinòn QB dekonpozab la, ki mwens estab epi ki souvan pèdi pandan pwosesis preparasyon an (33). Anplis de sa, li konnen ke retire LH1 ak lipid siklik natirèl yo nan RC ka gen yon enpak sou fonksyon yo, tankou dire lavi ki pi kout nan eta P+QB separe pa chaj la (31, 34, 35). Se poutèt sa, nou espekile ke egzistans bag LH1 lokal ki antoure RC a ka kenbe sit QB "fèmen" an, kidonk prezève anviwònman lokal la toupre QB a.
Malgre ke apolipoprotein (san kinòn QB) ak estrikti konplè a reprezante sèlman de imaj sou chanjman sit QB a, olye de yon seri evènman, gen endikasyon ki montre ke yo ka bloke lyezon an pou anpeche idrokinon an relye l pou anpeche inibisyon substrat la. Entèraksyon kinòlòl ak kinòn toupre sit QB apolipoprotein nan ka diferan, sa ki mennen nan rejè li pa RC. Yo te pwopoze depi lontan ke chanjman konfòmasyon yo jwe yon wòl nan lyezon ak rediksyon kinòn yo. Kapasite RC konjele yo pou diminye kinòn apre adaptasyon nan fènwa a afekte (36); kristalografi radyografi montre ke domaj sa a se akòz kinòn QB yo ki bloke nan yon konfòmasyon "distal" apeprè 4.5 Å soti nan pozisyon proksimal aktif la (26), 37). Nou sijere ke konfòmasyon lyezon distal sa a se yon imaj eta entèmedyè ant apolipoprotein ak estrikti bag konplè a, ki swiv entèraksyon inisyal la ak kinòn ak ouvèti sit QB a.
RC tip II ki jwenn nan konplèks PSII sèten bakteri ak syanobakteri fototwofik, alg ak plant yo gen konsèvasyon estriktirèl ak fonksyonèl (38). Aliyman estriktirèl ki montre nan Figi 6 (D ak E) mete aksan sou resanblans ki genyen ant RC PSII yo ak sit QB konplèks RC bakteri a. Konparezon sa a te lontan yon modèl pou etidye sistèm lyezon ak rediksyon kinòn ki gen rapò sere. Piblikasyon anvan yo te sijere ke chanjman konfòmasyon yo akonpaye pa rediksyon PSII kinòn yo (39, 40). Se poutèt sa, lè nou konsidere konsèvasyon evolisyonè RC a, mekanis lyezon sa a ki pa t obsève anvan an ka aplikab tou nan sit QB RC PSII nan plant fototwofik oksijene yo.
Souch Rps ΔpufW (sipresyon pufW san mak) ak PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ki eksprime nan locus pufW natirèl la). palustris CGA009 te dekri nan travay anvan nou an (16). Souch sa yo ak paran izojenik sovaj la te rekipere nan frizè a lè yo te simen yon ti kantite selil sou yon plak PYE (chak 5 g lit -1) (ki estoke nan LB a -80 °C, ki gen 50% (w/v) pwoteyin gliserol), ekstrè ledven ak agar siksinat) [1.5% (w/v)]. Plak la te enkube lannwit lan nan fènwa a tanperati chanm nan kondisyon anaerobik, epi answit li te eklere ak limyè blan (~50 μmolm-2 s-1) ki te founi pa anpoul alojèn OSRAM 116-W (RS Components, UK) pandan 3 a 5 jou jiskaske yon sèl koloni te parèt. Yo te itilize yon sèl koloni pou inokile 10 ml medyòm M22+ (41) complété ak 0.1% (w/v) asid kazamin (ki rele M22 apre sa). Yo te kiltive kilti a nan kondisyon ki ba nan oksijèn nan fènwa a 34°C avèk ajitasyon a 180 rpm pandan 48 èdtan, epi answit yo te inokile 70 ml kilti a nan menm kondisyon yo pandan 24 èdtan. Yo te itilize yon kilti semi-aerobik ak yon volim 1 ml pou inokile 30 ml medyòm M22 nan yon boutèy an vè transparan inivèsèl 30 ml ak bouchon vis epi yo te iradye l avèk ajitasyon (~50μmolm-2 s-1) pandan 48 èdtan avèk yon baton ajitasyon fòs mayetik esteril. Apre sa, yo te inokile 30 ml kilti a avèk anviwon 1 lit kilti nan menm kondisyon yo, epi yo te itilize kilti sa a pou inokile anviwon 9 lit kilti ki te eklere a ~200 μmolm-2 s-1 pandan 72 èdtan. Yo te rekòlte selil yo pa santrifijasyon a 7132 RCF pandan 30 minit, yo te resispann yo nan ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), epi yo te estoke yo a -20°C jiskaske yo te bezwen yo.
Apre deglase, ajoute kèk kristal dezoksiribonikleaz I (Merck, UK), lizozim (Merck, UK) ak de grenn inibitè pwoteaz oloanzim Roche (Merck, UK) nan selil ki te resispann yo. Nan yon selil presyon franse 20,000 psi (Aminco, USA), selil yo te deranje 8 a 12 fwa. Apre yo fin retire selil ki pa kase yo ak debri ensolub yo pa santrifijasyon a 18,500 RCF pandan 15 minit a 4°C, manbràn nan te presipite nan liza pigmante a pa santrifijasyon a 113,000 RCF pandan 2 èdtan a 43,000°C. Jete fraksyon soluble la epi resispann manbràn ki gen koulè a ​​nan 100 a 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) epi omojene jiskaske pa gen okenn agregasyon vizib. Manbràn sispann lan te enkube nan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) ki gen 2% (w/v) β-DDM pandan 1 èdtan nan fènwa a 4°C avèk yon ti brase. Apre sa, santrifije a 70°C pou fonn 150,000 RCF a 4°C pandan 1 èdtan pou retire rès materyèl ensolub yo.
Yo te aplike manbràn solubilizan ki soti nan souch ΔpufW la sou yon kolòn echanj iyon DEAE Sepharose 50 ml avèk twa volim kolòn (CV) nan tanpon lyezon [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ki gen 0.03% (w/v) β-DDM]. Lave kolòn nan avèk de tanpon lyezon CV, epi answit lave kolòn nan avèk de tanpon lyezon ki gen 50 mM NaCl. Konplèks RC-LH116 la te elye avèk yon gradyan lineyè 150 a 300 mM NaCl (nan tanpon lyezon) sou 1.75 CV, epi yo te elye rès konplèks lyezon an avèk yon tanpon lyezon ki gen 300 mM NaCl sou 0.5 CV. Kolekte spectre absòpsyon an ant 250 ak 1000 nm, kenbe fraksyon ki gen rapò absòbans (A880/A280) ki pi gran pase 1 nan 880 a 280 nm, delye li de fwa nan tanpon lyezon an, epi sèvi ak menm pwosedi a ankò sou kolòn DEAE a lè w ap pirifye l. Delye fraksyon ki gen rapò A880/A280 ki pi wo pase 1.7 ak rapò A880/A805 ki pi wo pase 3.0, fè twazyèm seri echanj iyon an, epi kenbe fraksyon ki gen rapò A880/A280 ki pi wo pase 2.2 ak rapò A880/A805 ki pi wo pase 5.0. Konplèks ki pasyèlman pirifye a te konsantre a ~2 ml nan yon filt santrifij Amicon 100,000 molekilè pwa koupe (MWCO) (Merck, UK), epi chaje sou yon kolòn esklizyon gwosè Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) ki genyen 200 mM NaCl tampon, epi answit elye nan menm tampon an a 1.5 CV. Kolekte spèk absòpsyon fraksyon esklizyon gwosè a, epi konsantre spèk absòpsyon yo ak rapò A880/A280 plis pase 2.4 ak rapò A880/A805 plis pase 5.8 a 100 A880, epi itilize yo imedyatman pou preparasyon griy cryo-TEM oswa depo. Kenbe a -80°C jiskaske ou bezwen yo.
Yo te aplike manbràn solubilizan ki soti nan souch PufW-His la sou yon kolòn HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ki genyen 200 mM NaCl ak 0.03% (w/w)) nan tanpon IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Yo te lave kolòn nan avèk senk CV tanpon IMAC, epi answit avèk senk CV tanpon IMAC ki genyen 10 mM istidin. Yo te retire konplèks prensipal la nan kolòn nan avèk senk tanpon IMAC ki genyen 100 mM istidin. Yo konsantre fraksyon ki genyen konplèks RC-LH114-W la a ~10 ml nan yon tank ki gen yon filt Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK) anba agitasyon, yo dilye l 20 fwa avèk tanpon lyezon, epi answit yo ajoute l nan 25 ml. Nan kolòn DEAE Sepharose la, yo itilize kat CV ki lye ak tanpon an davans. Lave kolòn nan avèk kat tanpon lyezon CV, apresa elye konplèks la sou uit CV sou yon gradyan lineyè 0 a 100 mM NaCl (nan tanpon lyezon), epi kat CV ki rete yo ki gen 100 mM tanpon lyezon. Konplèks rezidyèl yo ki te elye sou fraksyon klori sodyòm lan konbine avèk rapò A880/A280 ki pi wo pase 2.4 ak rapò A880/A805 ki pi wo pase 4.6 yo te konsantre a ~2 ml nan yon filt santrifij Amicon 100,000 MWCO, epi ranpli ak 1.5 CV IMAC davans. Kolòn esklizyon gwosè Superdex 200 16/600 ekilibre ak yon tanpon, epi apresa elye nan menm tanpon an sou 1.5 CV. Kolekte spèk absòpsyon fraksyon esklizyon gwosè yo epi konsantre spèk absòpsyon yo ak rapò A880/A280 plis pase 2.1 ak rapò A880/A805 plis pase 4.6 pou rive nan 100 A880, ke yo itilize imedyatman pou preparasyon griy TEM konjele oubyen estoke nan -80°C jiskaske yo bezwen.
Yo te itilize yon frizè imèsyon Leica EM GP pou prepare griy TEM tanperati ba. Yo te delye konplèks la nan yon tanpon IMAC rive nan yon A880 50, epi answit yo te chaje 5μl sou yon may kwiv QUANTIFOIL 1.2/1.3 kouvri ak kabòn ki fèk dechaje lumineux (Agar Scientific, UK). Enkube griy la a 20°C ak 60% imidite relatif pandan 30 s, answit siye l sèk pandan 3 s, epi tranpe l nan etan likid a -176°C.
Yo te anrejistre done konplèks RC-LH114-W la sou eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) avèk yon mikwoskòp Titan Krios, ki fonksyone nan yon vòltaj akselerasyon 300kV, ak yon agrandisman nominal 130,000× ak yon enèji - Chwazi yon espas 20 eV. Yo te itilize yon Gatan 968 GIF Quantum ak yon detektè pik K2 pou anrejistre imaj nan mòd kontaj pou kolekte done yo. Gwosè pixel kalibre a se 1.048 Å, epi to dòz la se 3.83 e-Å-2s-1. Yo te kolekte fim nan nan 11 segonn epi divize l an 40 pati. Yo te itilize zòn ki kouvri ak kabòn nan pou refokalize mikwoskòp la, epi answit kolekte twa fim pou chak twou. Antou, yo te kolekte 3130 fim, ak valè defokalizasyon ant -1 ak -3 μm.
Yo te kolekte done pou konplèks RC-LH116 la lè l sèvi avèk menm mikwoskòp la nan Laboratwa Biostrikti Asterbury (Inivèsite Leeds, UK). Yo te kolekte done yo nan mòd kontaj ak yon agrandisman 130 k, epi yo te kalibre gwosè pixel la a 1.065 Å ak yon dòz 4.6 e-Å-2s-1. Yo te anrejistre fim nan nan 12 segonn epi li te divize an 48 pati. Antou, yo te kolekte 3359 fim, ak valè defokalizasyon ant -1 ak -3μm.
Tout tretman done yo fèt nan tiyo Relion 3.0 la (42). Sèvi ak Motioncorr 2 (43) pou korije mouvman gwo bout bwa a pa pondération dòz, epi answit sèvi ak CTFFIND 4.1 (44) pou detèmine paramèt CTF (fonksyon transfè kontras). Fotomikwograf tipik apre etap tretman inisyal sa yo montre nan Figi 2. S16. Modèl seleksyon otomatik la pwodui lè yo chwazi manyèlman anviwon 250 pixel ki gen 1000 patikil nan yon ankadreman 250 pixel epi san okenn klasifikasyon bidimensyonèl (2D) referans, kidonk yo rejte klasifikasyon sa yo ki satisfè kontaminasyon echantiyon an oswa ki pa gen okenn karakteristik aparan. Apre sa, yo te fè seleksyon otomatik sou tout mikwofotograf yo, epi RC-LH114-W la te gen 849,359 patikil, epi konplèks RC-LH116 la te gen 476,547 patikil. Tout patikil yo chwazi yo te sibi de seri klasifikasyon 2D ki pa referans, epi apre chak seri, patikil ki rankontre zòn kabòn nan, kontaminasyon echantiyon an, pa gen okenn karakteristik evidan oswa patikil ki sipèpoze anpil yo rejte, sa ki lakòz 772,033 (90.9%) ak 359,678 (75.5%) patikil. Yo itilize patikil pou klasifikasyon 3D RC-LH114-W ak RC-LH116 respektivman. Yo te pwodui modèl referans 3D inisyal la lè l sèvi avèk metòd desant gradyan estokastik la. Lè w sèvi ak modèl inisyal la kòm referans, patikil yo chwazi yo klase an kat kategori an 3D. Lè w sèvi ak modèl ki nan kategori sa a kòm referans, fè rafinman 3D sou patikil ki nan pi gwo kategori a, answit sèvi ak filtè ba-pas 15Å inisyal la pou kouvri zòn sòlvan an, ajoute 6 piksèl ak bor mou, epi fè pòs-trete piksèl yo pou korije fonksyon transfè Modilasyon pik Gatan K2 detektè ki anlè a. Pou seri done RC-LH114-W la, yo te modifye modèl inisyal sa a lè yo te retire dansite fò a nan kwen mask la (ki pa konekte ak dansite konplèks nwayo a nan UCSF Chimera). Modèl ki sòti yo (rezolisyon RC-LH114-W ak RC-LH116 yo se 3.91 ak 4.16 Å, respektivman) yo itilize kòm yon referans pou dezyèm tou klasifikasyon 3D a. Patikil yo itilize yo gwoupe nan klas 3D inisyal la epi yo pa gen yon korelasyon fò ak vwazinaj la. Sipèpoze oswa mank karakteristik estriktirèl evidan. Apre dezyèm tou klasifikasyon 3D a, yo te chwazi kategori ki gen pi gwo rezolisyon an [Pou RC-LH114-W, yon kategori se 377,703 patikil (44.5%), pou RC-LH116, gen de kategori, ki totalize 260,752 patikil (54.7%), Kote yo se menm bagay la sèlman lè yo aliyen apre wotasyon inisyal la ak yon ti diferans]. Patikil yo chwazi yo re-ekstrè nan yon bwat 400 piksèl epi rafine pa rafinman 3D. Mask solvang lan pwodui lè l sèvi avèk filtè low-pass 15Å inisyal la, ekspansyon kat 3 piksèl ak mask mou 3 piksèl. Lè l sèvi avèk rafinman CTF pa patikil, koreksyon mouvman pa patikil ak dezyèm tou rafinman CTF pa patikil, rafinman 3D, maskaj solvang ak pòs-tretman yo fèt apre chak etap pou amelyore teksti ki kapab lakòz la pi lwen. Lè l sèvi avèk valè papòt FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0.143, rezolisyon modèl final RC-LH114-W ak RC-LH116 yo se 2.65 ak 2.80Å, respektivman. Koub FSC modèl final la montre nan Figi 2. S17.
Tout sekans pwoteyin yo telechaje nan UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) te itilize pou konstwi yon modèl omoloji RC, ki gen ladan sekans pwoteyin RC-L, RC-M ak RC-H ansanm ak estrikti kristal Rba. sphaeroides RC te itilize kòm yon modèl (PDB ID: 5LSE) (46). Sèvi ak zouti "fit map" ki nan UCSF Chimera pou anfòm modèl ki pwodui a ak kat la (47), amelyore estrikti pwoteyin nan, epi sèvi ak Coot (48) pou ajoute kofaktè [4×BChl a (non rezidi bibliyotèk monomè = BCL), 2×BPh a (BPH), youn oubyen de kalite UQ10 (U10), yon fè ki pa èm (Fe) ak yon 3,4-diidroeksakarbonilkolin (QAK)]. Piske QAK pa disponib nan bibliyotèk monomè a, li te parametrize lè l sèvi avèk zouti eLBOW ki nan PHENIX (49).
Apre sa, yo te konstwi sou-inite LH1 la. Okòmansman, yo te itilize zouti konstriksyon otomatik ki nan PHENIX (49) la pou konstwi otomatikman yon pati nan sekans LH1 la lè l sèvi avèk kat jeyografik la ak sekans pwoteyin LH1-α ak LH1-β kòm done antre. Chwazi sou-inite LH1 ki pi konplè a, ekstrè li epi chaje li nan Coot, ajoute sekans ki manke a ladan l manyèlman, epi rafine tout estrikti a manyèlman anvan ou ajoute de BCl a (BCL) ak yon spirilloxanthin (CRT) [dapre Rps ki enpòtan yo. Dansite konplèks LH1 la ak kontni karotenoid li te ye a. Espès (17)]. Kopye sou-inite LH1 konplè a, epi sèvi ak "Zouti Kat Akèy" UCSF Chimera a pou akèyi nan zòn adjasan ki pa modèl dansite LH1 la, epi rafine li nan Coot; repete pwosesis la jiskaske tout sou-inite LH1 yo fin modle. Pou estrikti RC-LH114-W la, lè yo ekstrè dansite ki pa asiyen an nan Coot la, pwoteyin nan separe de konpozan ki pa pwoteyin ki rete yo nan kat USCF Chimera a epi yo itilize zouti Autobuild la pou etabli modèl inisyal la, ak modèlizasyon sou-inite ki rete yo (pwoteyin-W). Nan PHENIX (49). Ajoute nenpòt sekans ki manke nan modèl ki kapab lakòz la nan Coot (48), epi rafine tout sou-inite a manyèlman. Dansite ki pa asiyen ki rete a anfòm konbinezon lipid yo (ID bibliyotèk monomè PDB CDL = CDL, POPC = 6PL ak POPG = PGT), detèjan β-DDM (LMT) ak molekil UQ10 (U10). Sèvi ak optimize PHENIX (49) ak optimize manyèl nan Coot (48) pou pèfeksyone modèl inisyal konplè a jiskaske estatistik modèl la ak kalite vizyèl ajisteman an pa ka amelyore plis. Finalman, sèvi ak LocScale (50) pou file kat lokal la, epi fè plizyè lòt sik modèlizasyon dansite ki pa asiyen an ak optimize otomatik ak manyèl.
Peptid, kofaktè ak lòt lipid ak kinòn respektif yo ki lye nan dansite respektif yo montre nan Figi 1 ak 2. S18 rive S23. Enfòmasyon estatistik modèl final la montre nan Tablo S1.
Sof si yo presize otreman, yo te kolekte spèk absòpsyon UV/Vis/NIR yo sou yon spektrofotomèt Cary60 (Agilent, USA) nan entèval 1 nm soti nan 250 nm rive nan 1000 nm ak yon tan entegrasyon 0.1s.
Diluye echantiyon an nan yon kivèt kwatz ak yon chemen 2 mm rive nan A880 ki egal a 1, epi kolekte spectre absòpsyon an ant 400 ak 1000 nm. Yo te kolekte spectre dikwoik sikilè yo sou yon espektropolarimèt Jasco 810 (Jasco, Japon) nan entèval 1 nm ant 400 nm ak 950 nm nan yon vitès eskanè 20 nm min-1.
Koyefisyan ekstansyon molè a detèmine lè yo dilue konplèks debaz la rive nan yon A880 apeprè 50. Dilue volim 10μl la nan 990μl tanpon lyezon oswa metanòl, epi kolekte spectre absòpsyon an imedyatman pou minimize degradasyon BChl. Yo kalkile kontni BChl nan chak echantiyon metanòl la lè yo itilize koyefisyan ekstansyon an nan 771 nm ki se 54.8 mM-1 cm-1, epi yo detèmine koyefisyan ekstansyon an (51). Divize konsantrasyon BChl ki mezire a pa 32 (RC-LH114-W) oswa 36 (RC-LH116) pou detèmine konsantrasyon konplèks debaz la, ki answit itilize pou detèmine spectre absòpsyon menm echantiyon yo kolekte nan tanpon an paralèl. Koyefisyan ekstansyon an te pran twa mezi repete pou chak echantiyon, epi yo te itilize absòbans mwayèn maksimòm Qy BChl la pou kalkil la. Koyefisyan ekstèksyon RC-LH114-W la ki mezire nan 878 nm se 3280±140 mM-1 cm-1, alòske koyefisyan ekstèksyon RC-LH116 la ki mezire nan 880 nm se 3800±30 mM-1 cm-1.
Yo te kantifye UQ10 la dapre metòd ki nan (52) la. An brèf, yo te fè HPLC faz envès (RP-HPLC) la lè l sèvi avèk sistèm Agilent 1200 HPLC la. Fonn anviwon 0.02 nmol RC-LH116 oswa RC-LH114-W nan 50μl 50:50 metanòl:klorofòm ki gen 0.02% (w/v) klori ferik, epi enjekte Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ki te deja ekilibre a. Fonn nan 1 ml-1 min-1 a 40°C nan yon solvan HPLC (80:20 metanòl:2-propanol) sou yon kolòn ×25 cm. Fè elisyon izokratik nan yon solvan HPLC pou kontwole absòbans nan 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) ak 780 nm (BChl) pandan 1 èdtan. Yo te entegre pik ki nan kromatogram 275 nm nan 25.5 minit yo, ki pa t gen okenn lòt konpoze detektab. Yo itilize zòn entegre a pou kalkile kantite molè UQ10 ki te ekstrè a an referans ak koub kalibrasyon ki kalkile apati enjeksyon estanda pi yo soti nan 0 a 5.8 nmol (Figi S14). Yo te analize chak echantiyon an twa replikasyon, epi erè ki rapòte a koresponn ak SD mwayèn nan.
Yo te prepare yon solisyon ki genyen konplèks RC-LH1 la ak yon absòpsyon Qy maksimòm de 0.1 avèk 30 μM sitokrom c2 kè cheval redwi (Merck, UK) ak 0 a 50 μMUQ2 (Merck, UK). Yo te prepare twa echantiyon 1 ml pou chak konsantrasyon UQ2 epi yo te enkube yo pandan lannwit nan fènwa a 4°C pou asire yon adaptasyon konplè nan fènwa a anvan mezi a. Yo te chaje solisyon an nan yon espektrofotomèt modilè OLIS RSM1000 ekipe ak yon flanm dife 300 nm/griyaj 500 liy, yon antre 1.24 mm, yon mitan 0.12 mm ak fant sòti 0.6 mm. Yo mete yon filt pasaj long 600 nm nan antre fototib echantiyon an ak tib fotomiltiplikatè referans lan pou eskli limyè eksitasyon an. Yo te kontwole absòbans lan a 550 nm ak yon tan entegrasyon 0.15 s. Limyè eksitasyon an emèt soti nan yon LED (Light Emitting Diode) 880 nm M880F2 (Thorlabs Ltd., UK) atravè yon kab fib optik ak yon entansite 90% atravè yon kontwolè DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) epi li emèt nan sous limyè a nan yon ang 90°. Reyon mezi a opoze ak miwa a pou retounen nenpòt limyè ki pa t absòbe okòmansman pa echantiyon an. Kontwole absòbans lan 10 s anvan iluminans 50 s la. Apre sa, yo te kontwole absòbans lan plis pandan 60 s nan fènwa a pou evalye nan ki pwen kinolol diminye sitokrom c23 + espontaneman (gade Figi S8 pou done brit yo).
Yo te trete done yo lè yo te ajiste yon to inisyal lineyè nan yon peryòd 0.5 a 10 s (selon konsantrasyon UQ2 a) epi yo te pran mwayèn to tout twa echantiyon yo pou chak konsantrasyon UQ2. Yo te itilize konsantrasyon RC-LH1 ki te kalkile apati koyefisyan disparisyon respektif la pou konvèti to a an efikasite katalitik, yo te trase l nan Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), epi yo te ajiste l sou modèl Michaelis-Menten an pou detèmine valè Km ak Kcat aparan yo.
Pou mezi absòpsyon pasajè yo, echantiyon RC-LH1 la te delye a ~2μM nan yon tanpon IMAC ki gen 50 mM ascorbate sodyòm (Merck, USA) ak 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Yo itilize asid ascorbic kòm yon donatè elektwon sakrifisyèl, epi yo itilize tert-butaclofen kòm yon inibitè QB pou asire ke donatè RC prensipal la rete redwi (sa vle di, pa fotookside) pandan tout pwosesis mezi a. Yo ajoute apeprè 3 ml echantiyon nan yon selil wotasyon koutim (apeprè 0.1 m an dyamèt, 350 RPM) ak yon longè chemen optik 2 mm pou asire ke echantiyon an nan chemen lazè a gen ase tan pou adaptasyon nan fènwa ant pulsasyon eksitasyon yo. Sèvi ak pulsasyon lazè ~100-fs pou anplifye sistèm lazè Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) pou eksite echantiyon an a 880 nm nan yon vitès repetisyon 1 kHz (20 nJ pou NIR oswa 100 nJ pou Vis). Anvan ou kolekte done yo, ekspoze echantiyon an a limyè eksitasyon pandan anviwon 30 minit. Ekspozisyon an ap lakòz inaktivasyon QA (petèt diminye QA yon fwa oubyen de fwa). Men, tanpri sonje ke pwosesis sa a revèsib paske apre yon long peryòd adaptasyon nan fènwa, RC ap retounen dousman nan aktivite QA. Yo te itilize yon espektwomèt Helios (Ultrafast Systems, USA) pou mezire spectre tranzitwa yo ak yon tan reta -10 a 7000 ps. Sèvi ak lojisyèl Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) pou degwoupe ansanm done yo, answit fizyone yo epi estandadize yo. Sèvi ak pake lojisyèl CarpetView (Light Conversion Ltd., Lityani) pou itilize ansanm done yo pou jwenn spectre diferansyèl ki gen rapò ak dezentegrasyon, oubyen itilize yon fonksyon ki konvolve plizyè eksponan ak repons enstriman an pou anfòm evolisyon spectre yon sèl longèdonn nan Origin (OriginLab, USA).
Jan nou te mansyone pi wo a (53), yo te prepare yon fim fotosentetik ki gen konplèks LH1 ki pa gen ni antèn RC ni antèn LH2 periferik la. Yo te dilye manbràn nan nan 20 mM tris (pH 8.0) epi answit yo te chaje l nan yon kivèt kwatz ak yon chemen optik 2 mm. Yo te itilize yon pulsasyon lazè 30nJ pou eksite echantiyon an a 540 nm ak yon tan reta -10 a 7000 ps. Trete seri done yo jan yo dekri l pou echantiyon Rps.pal la.
Yo te santrifije manbràn nan nan yon pellet a 150,000 RCF pandan 2 èdtan a 4°C, epi answit yo te resispann absòbans li a 880 nm nan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ak 200 mM NaCl. Fonn manbràn nan lè w brase dousman nan 2% (w/v) β-DDM pandan 1 èdtan nan fènwa a 4°C. Yo te delye echantiyon an nan 100 mM triyetilamonyòm kabonat (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) rive nan yon konsantrasyon pwoteyin 2.5 mg ml-1 (analiz Bio-Rad). Yo te fè plis pwosesis apati metòd ki te pibliye deja a (54), kòmanse avèk dilisyon 50 μg pwoteyin nan yon total 50 μl TEAB ki gen 1% (w/v) laurat sodyòm (Merck, UK). Apre sonikasyon pandan 60 s, li te redwi ak 5 mM tris(2-karboksetikil)fosfin (Merck, UK) a 37°C pandan 30 minit. Pou S-alkilasyon, enkube echantiyon an ak 10 mM metil S-metiltiyometansulfonat (Merck, UK) epi ajoute li soti nan yon solisyon stock izopropanol 200 mM pandan 10 minit nan tanperati chanm. Dijesyon pwoteyolitik te fèt lè yo te ajoute 2 μg melanj tripsin/endoproteinaz Lys-C (Promega UK) epi enkube a 37°C pandan 3 èdtan. Tensioaktif laurat la te ekstrè lè yo te ajoute 50 μl asetat etilik ak 10 μl asid trifluoroacetic 10% (v/v) LC grade (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) epi brase pandan 60 s. Separasyon faz la te ankouraje pa santrifijasyon a 15,700 RCF pandan 5 minit. Selon pwotokòl manifakti a, yo te itilize yon kolòn wotasyon C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) pou aspire ak retire sèl nan faz ki pi ba a ki gen peptid la avèk anpil atansyon. Apre yo fin siye echantiyon an pa santrifijasyon vakyòm, yo te fonn li nan 0.5% TFA ak 3% asetonitril, epi yo te analize 500 ng pa kromatografi nanoflow RP makonnen ak espektwometri mas lè l sèvi avèk paramèt sistèm yo te detaye deja.
Sèvi ak MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pou idantifikasyon ak kantifikasyon pwoteyin pou chèche baz done pwoteyom Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Done pwoteyomik espektwometri mas yo te depoze nan ProteomeXchange Alliance atravè depo patnè PRIDE la (http://proteomecentral.proteomexchange.org) anba idantifikatè seri done PXD020402 la.
Pou analiz pa RPLC makonnen ak espektwometri mas iyonizasyon elektwosprey, konplèks RC-LH1 la te prepare apati Rps sovaj yo. Lè l sèvi avèk metòd ki te pibliye deja a (16), konsantrasyon pwoteyin ki te pwodui nan selil palustris yo te 2 mg ml-1 nan 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl ak 0.03% (w/v) β- (analiz Bio-Rad)) DDM. Selon pwotokòl manifakti a, itilize twous pirifikasyon 2D (GE Healthcare, USA) pou ekstrè 10 μg pwoteyin pa metòd presipitasyon, epi fonn presipite a nan 20 μl 60% (v/v) asid formik (FA), 20% (v/v) Asetonitril ak 20% (v/v) dlo. Senk mikrolit te analize pa RPLC (Dionex RSLC) makonnen ak espektwometri mas (Maxis UHR-TOF, Bruker). Sèvi ak kolòn MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) pou separasyon a 60°C ak 100μlmin -1, avèk yon gradyan 85% (v/v) sòlvan A [0.1% (v/v) FA ak 0.02% (V/v) solisyon akeuz TFA] rive nan 85%(v/v) sòlvan B [0.1%(v/v) FA ak 0.02%(v/v) nan 90%(v/v) asetonitril TFA]. Lè w sèvi ak sous iyonizasyon elektwoespre estanda ak paramèt default pou plis pase 60 minit, espektwomèt mas la jwenn 100 a 2750 m/z (rapò mas-a-chaj). Avèk èd zouti pòtal resous byoenformatik ExPASy FindPept la (https://web.expasy.org/findpept/), trase spectre mas la sou sou-inite konplèks la.
Selil yo te kiltive pandan 72 èdtan anba 100 ml limyè NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) oswa high (300μMm-2 s-1). Mwayen M22 (mwayen M22 kote yo pa mete silfat amonyòm epi yo ranplase sikinat sodyòm ak asetat sodyòm) nan yon boutèy vis 100 ml (23). Nan senk sik 30 segonn, yo te mete pèl an vè 0.1 mikron nan yon rapò volim 1:1 pou lize selil yo epi yo te refwadi yo sou glas pandan 5 minit. Yo te retire matyè ensolubl la, selil ki pa kase yo ak pèl an vè yo pa santrifijasyon a 16,000 RCF pandan 10 minit nan yon mikrosantrifij sou tab la. Yo te separe manbràn lan nan yon rotor Ti 70.1 avèk 100,000 RCF nan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) avèk yon gradyan sikwoz 40/15% (p/p) pandan 10 èdtan.
Jan nou te dekri sa nan travay anvan nou an, imunodeteksyon etikèt His la sou PufW (16). An brèf, konplèks nwayo pirifye a (11.8 nM) oswa manbràn ki gen menm konsantrasyon RC a (detèmine pa oksidasyon ki soustrè spectre diferans redwi a epi ki matche chaj la sou jèl ki te kolore a) nan yon tanpon chajman 2x SDS (Merck, UK) dilye de fwa. Pwoteyin yo te separe sou yon kopi jèl NuPage 12% bis-tris (Thermo Fisher Scientific, UK). Yo te kolore yon jèl ak Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) pou chaje ak vizyalize souinite RC-L la. Pwoteyin ki sou dezyèm jèl la te transfere nan manbràn polivinilidèn fliyò aktive ak metanòl (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, UK) pou imunotès. Manbràn PVDF la te bloke nan 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 ak 5% (w/v) lèt an poud ekreme, epi answit yo te enkube l ak antikò prensipal anti-His la (nan yon solisyon tanpon antikò dilué [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl ak 0.05% (v/v) Tween-20] nan 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) pandan 4 èdtan. Apre yo te fin lave manbràn nan 3 fwa pandan 5 minit nan yon tanpon antikò, yo te konbine manbràn nan avèk yon antikò segondè anti-souris ak peroksidaz raifò (Sigma-Aldrich, UK) (dilye 1:10,000 nan yon tanpon antikò). Mete l nan enkube pou pèmèt deteksyon an (5 minit apre 3 lave nan yon tanpon antikò) lè l sèvi avèk yon substrat chimiluminesans WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Itali) ak yon Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Lè w trase distribisyon entansite chak jèl kolore oswa liy imunotès, entegre zòn ki anba pik la epi kalkile rapò entansite RC-L (jèl kolore) ak Pwoteyin-W (imunotès), nan ImageJ (57) Trete imaj la. Rapò sa yo te konvèti an rapò molè lè w sipoze ke rapò RC-L ak pwoteyin-W nan echantiyon RC-LH114-W pi a te 1:1 epi w nòmalize tout seri done yo kòmsadwa.
Pou plis materyèl pou atik sa a, tanpri gade http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Sa a se yon atik aksè ouvè distribye anba kondisyon Lisans Atribisyon Creative Commons lan. Atik la pèmèt itilizasyon, distribisyon ak repwodiksyon san restriksyon nan nenpòt mwayen avèk kondisyon ke travay orijinal la byen site.
Nòt: Nou sèlman mande w pou w bay adrès imel ou pou moun ou rekòmande sou paj la ka konnen ou vle yo wè imel la epi li pa spam. Nou p ap pran okenn adrès imel.
Kesyon sa a sèvi pou teste si ou se yon vizitè epi pou anpeche soumèt spam otomatik.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Estrikti gwo rezolisyon konplèks pyèj limyè 1 nan sant reyaksyon an bay nouvo apèsi sou dinamik kinòn lan.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Estrikti gwo rezolisyon konplèks pyèj limyè 1 nan sant reyaksyon an bay nouvo apèsi sou dinamik kinòn lan.
©2021 Asosyasyon Ameriken pou Avansman Syans. tout dwa rezève. AAAS se yon patnè HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ak COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.